干货| 酵母杂交技术从理论到实践，一文轻松掌握-凯发k8网页登录

    在生命科学的广阔领域中，理解基因如何调控蛋白质的功能以及蛋白质之间如何相互作用是揭示生命活动本质的关键步骤。酵母杂交技术，特别是酵母单杂交（yeast one-hybrid, y1h）和酵母双杂交（yeast two-hybrid, y2h）系统，是解析基因调控与蛋白质互作的利器。尽管y1h和y2h系统都利用了酵母细胞作为研究平台，但它们的核心机制和应用范围存在显著差异。本文将带领读者朋友们深入了解这两项技术的核心精髓，揭示它们如何在生命科学研究中开拓新知，为理解细胞内的精细调控机制提供极大助力。

一、酵母双杂交（yeast two-hybrid, y2h）

    酵母双杂交（y2h）是一种强大的蛋白质相互作用筛选技术。在y2h系统中，两个潜在相互作用的蛋白质分别被融合到两个不同的酵母转录因子结构域上：一个通常是dna结合域（如gal4的bd域或lexa），另一个是转录激活域（如gal4的ad域）。当这两个融合蛋白在细胞内相遇并形成复合体时，它们会重新激活报告基因的转录，从而表明这两个蛋白质之间存在相互作用。

图源：https://www.cnki.net/

二、酵母单杂交（yeast one-hybrid, y1h）

    酵母单杂交技术由酵母双杂交基础上发展而来，主要用于鉴定能够与特定dna序列结合的蛋白质，如转录因子。在y1h系统中，一段已知的dna调控序列（如启动子或增强子）被克隆到酵母细胞中的报告基因上游。同时，一个候选蛋白质被融合到一个已知的转录激活域（如gal4的ad域），并在酵母细胞中表达。如果候选蛋白质能够结合到这段dna序列上，它将激活报告基因的表达，从而表明蛋白质与dna之间存在特异性结合。

图源：https://www.cnki.net/

三、两者的异同点

相同点：

    ● 两者都是基于酵母细胞的遗传学技术。

    ● 两者都使用报告基因的表达作为读出指标。

    ● 两者都需要构建特定的载体和酵母菌株。
 

不同点：

    ● 研究目标：y1h主要用于研究蛋白质与dna的相互作用，而y2h则专注于蛋白质之间的相互作用。

    ● 实验设计：y1h涉及一个dna序列和一个蛋白质的结合，而y2h涉及两个蛋白质的相互作用。

    ● 载体构建：y1h通常需要构建含有dna序列的载体和含有融合蛋白的载体，y2h则需要构建两个融合蛋白的载体。

    ● 结果解读：y1h的结果反映了蛋白质-dna结合的特异性，而y2h的结果则指示了蛋白质-蛋白质相互作用的存在。

    理解了y1h和y2h技术的实验原理和异同点之后，我们自然而然地将目光投向了它们在科研前沿的应用实例。接下来，让我们通过具体的文献案例，深入探索y1h和y2h在揭示基因调控网络、蛋白质相互作用图谱以及疾病机理研究中的实际应用。

案例一：酵母单杂交的运用
mdbbx22–mir858–mdmyb9/11/12模块调控苹果果皮中原花青素积累的分子机制 

    原花青素具有降低血压血脂、预防心血管疾病、抗肿瘤等多种有益于人体健康的功效。苹果中尤其是果皮富含原花青素等多种类黄酮物质，是膳食抗氧化剂的主要来源。本研究对苹果发育期果皮进行mirna高通量测序，鉴定出一个与原花青素含量高度负相关的mdm-mir858。mdm-mir858能够与调控原花青素合成的基因mdmy9/11/12序列互补配对。5’race实验、gus染色实验以及瞬时荧光素酶实验证明mdm-mir858能有效切割靶基因mdmyb9/11/12。通过酵母单杂交，作者发现mdbbx22能够和mdm-mir858启动子结合。在苹果愈伤组织中过表达mdbbx22能够促进mdm-mir858的表达进而抑制过表达mdmyb9/11/12背景下原花青素的积累。该研究结果揭示了苹果果皮mdbbx22-mir858-mdmyb9/11/12模块协同调控原花青素的积累，为进一步研究苹果果皮中原花青素调控机制以及原花青素和花青苷关系提供参考。 
 

图源：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13839

案例二：酵母双杂交的运用
蛋白激酶bin2调控植物低温应答的新机制

    低温是影响植物生长和分布的重要环境因子，研究植物抵抗低温的生理以及分子机制，对帮助我们改良作物性状具有重要意义。cbf类转录因子在冷锻炼(coldacclimation)过程中发挥着至关重要的作用。为了研究bin2（brassinosteroid-insensitive2）在植物应对低温胁迫反应过程中的作用机制，作者通过酵母双杂交、co-ip、pull-down等实验确证了bin2与ice1相互作用。进一步研究发现作为蛋白激酶，bin2能够磷酸化ice1促进后者的降解，最终降低了cbfs基因的表达。这项研究证明bin2是植物冷响应过程的一个重要开关，对揭示植物应答低温胁迫的分子机制有重要意义。
 

图源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc6881119/

    鉴于y1h和y2h拥有各自的技术优势与应用领域，在实际研究中二者也经常被搭配着使用，以获得更为全面和深入的理解。通过y1h识别关键的转录因子，再借助y2h探索这些转录因子与其他蛋白质的相互作用，研究人员能够构建起从基因调控到蛋白质复合体功能的完整链条，下面这篇文献就是这样一个思路。

案例三：酵母单杂交与酵母双杂交联合运用
茉莉酸反应性转录因子nnwrky70a和nnwrky70b正调控荷花中苄基异喹啉生物碱的生物合成

    苄基异喹啉生物碱 (bia) 是植物中的一组多样化的含氮次级代谢物，仅存在于有限的植物科。具有药理意义，然而，人们对bia的生物合成和调控知之甚少。在该研究中，作者通过：（1）系统发育分析表明，nnwrky70a 和 nnwrky70b 为典型的可参与植物次生代谢调节的iii 组 wrky蛋白；（2）双荧光素酶和酵母单杂交实验表明，nnwrky70a 和 nnwrky70b 可以特异性结合bia 途径基因启动子的 w-box顺式元件，从而正向调节荷花 bia 生物合成，nnwrky70b 的 bia 生物合成激活比 nnwrky70a 更强；（3）酵母双杂交和 bifc 分析进一步揭示nnwrky70b通过与在调节荷花 bia 生物合成中的关键蛋白之间的相互作用，调节荷花 bia 生物合成。以上的研究结果证明了 nnwrky70 tfs 在激活荷花中 bia 的生物合成中的积极调节作用，并为通过基于 tf 的基因工程提高 bia 产量提供了可行的策略。
 

图源：doi: 10.3389/fpls.2022.862915

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