干货图文| 双荧光素酶报告基因结果解读-凯发k8网页登录

    双荧光素酶报告基因检测是转录调控研究中十分重要的实验手段，主要应用于启动子和转录因子，以及mirna和其靶基因互作的验证。

    在前几期文章中，我们已经详细解介绍了双荧光素酶的原理、实验流程、常见问题与解答、在不同研究领域的应用等。详情参考如下链接：

 

    本期我们将跟您一起，看看实验做完了，我们拿到的实验结果是怎样的，又代表了什么呢？

 

microrna-靶基因

 

    microrna与靶基因互作的双荧光素酶实验通常使用pmirglo载体，这是一款由promega公司开发的，目前常用的一种商品化双荧光素酶报告载体，如下图所示：

 

（图源：promega凯发娱发k8官网）

    将靶基因序列插入到萤火虫荧光素酶序列的3‘utr区域一同转录成mrna，若microrna与靶基因发生了结合，则会使萤火虫荧光素酶的mrna提前降解或干扰其翻译，最终导致荧光值下降。

 

实验常见分组如下图所示：

 

    nc-mimics：作为microrna的对照，通常是一段随机的rna

    microrna-mimics：化学合成的与microrna拥有相同序列的rna

    3’utr-wt：靶基因原始序列

    3’utr-mt：将结合位点突变后的靶基因序列

 

    由于nc-mimics通常不会与rna发生结合，因此第①组与第③组是对照组的作用；

    若microrna能够与靶基因结合，根据上述原理，第②组荧光值会显著性下降；在此前提下，

    第④组由于突变了结合位点，microrna无法与突变后的靶基因结合，因此荧光值与第③组无显著性差异。

 

转录因子-启动子

    转录因子与启动子互作的双荧光素酶实验通常使用pgl3-basic载体，如下图所示：

（图源：promega凯发娱发k8官网）

 

    将靶基因序列插入到萤火虫荧光素酶序列的启动子位置一同转录成mrna，若转录因

    子与启动子发生结合，激活了萤火虫荧光素酶mrna的转录，则会导致荧光值上调，

    有的蛋白结合到启动子上反而会抑制mrna的转录，最终导致荧光值下调。

 

实验常见分组如下图所示：

 

    pcdna3.1：过表达转录因子或其他蛋白的空载质粒

    tf-pcdna3.1 ：插入了目的蛋白cds序列的目的蛋白过表达质粒

    promoter-wt：启动子的原始序列

    promoter-mt：将结合位点突变后的启动子序列

    tk：作为内参的海肾荧光表达质粒

 

    第①组与第③组转染的是蛋白空载质粒，起对照组的作用；若转录因子能够与启

动子结合并激活转录，根据上述原理，第②组荧光值会显著性上调，如果过表达的

是抑制转录的蛋白，则荧光值会下调；在此前提下，第④组由于突变了结合位点，

转录因子无法与突变后的启动子结合，因此荧光值与第③组无显著性差异。

 

 

下面让我们来看两个实际的案例：

案例一：microrna-靶基因

lncrna hotair promotes the growth and metastasis of gastric cancer by sponging mir-1277-5p and upregulating col5a1

    本文研究了长链非编码rna hotair在胃癌发生发展中的作用机制。研究表明，hotair能通过吸附mir-1277-5p并上调col5a1的表达，促进胃癌细胞的生长和转移。研究还发现，col5a1与胃癌免疫浸润程度有关，提示col5a1介导的胃癌细胞增殖可能与调节肿瘤微环境有关。此外，研究构建了一个基于col5a1的预后预测模型，表明col5a1可以作为胃癌的预后生物标志物。这项研究为胃癌的治疗提供了新的靶点。

 

在本文中，双荧光素酶实验用于验证 mir-1277-5p 与 hotair 和 col5a1 的靶向互作关系。

实验步骤：

    ① 报告基因质粒构建：将 hotair 和 col5a1 的野生型和突变型序列克隆到 pmirglo 载体中，构建成报告基因质粒。

    ② 转染细胞：将报告基因质粒和 mir-1277-5p mimics/inhibitor共转染到 293t 细胞中。

    ③ 检测荧光素酶活性：使用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性，并以内参基因 renilla luciferase 活性进行标准化。

fig. hotair exerted its role in gc by sponging mir-1277-5p and upregulating col5a1.[1]

n, o dual-luciferase reporter assay demonstrated that mir-1277-5p indeed interacted with hotair and col5a1.

 

实验结果：

    hotair-wt mir-1277-5p mimics组中，荧光素酶活性显著低于其他组别，说明 mir-1277-5p 与 hotair-wt 发生靶向结合，抑制了荧光素酶表达。

    hotair-wt mir-1277-5p inhibitor组中，荧光素酶活性显著高于其他组别，说明 mir-1277-5p inhibitor抑制了 mir-1277-5p 的功能，从而解除其对荧光素酶表达的抑制。

    hotair-mut mir-1277-5p mimics组和 hotair-mut mir-1277-5p inhibitor组中，荧光素酶活性没有显著差异，说明突变型序列不能与 mir-1277-5p 发生靶向结合。

该结果验证了 mir-1277-5p 可以与 hotair 和 col5a1 发生靶向结合，从而调控其表达。

 

案例二：转录因子-启动子

yy1-mediated reticulocalbin-2 upregulation promotes the hepatocellular carcinoma progression via activating myc signaling

    该研究探讨了yy1介导的网织蛋白2（rcn2）过表达如何通过激活myc信号通路促进肝细胞癌（hcc）的发展。研究通过pcr和wb方法检测了患者组织和细胞系中rcn2的表达，并结合公共数据库中hcc患者的临床信息。通过一系列生物学功能实验研究了rcn2在体内外的作用，并利用生物信息学方法确定了rcn2的上下游信号。结果显示，rcn2过表达与hcc患者预后较差有关，且在hcc的增殖、侵袭和迁移中起重要作用。研究发现yy1是rcn2的上游转录因子，可促进rcn2的表达，且rcn2通过myc信号通路参与hcc进展。此外，rcn2还能降低myc蛋白的蛋白酶体降解，进而推动hcc的发展。研究还发现，通过沉默myc可以减弱rcn2在hcc中的影响。总之，该研究强调了rcn2在肿瘤进展中的关键作用，并可能为hcc治疗提供潜在策略。

 

本文中，双荧光素酶实验主要用于验证 yy1 作为 rcn2 上游转录因子的作用。

实验步骤：

    ① 构建报告基因质粒：将 rcn2启动子序列克隆到萤火虫荧光素酶表达载体上，构建成报告基因质粒。

    ② 转染细胞：将构建好的报告基因质粒与 pcdna3.1-yy1 和空载体质粒共转染 huh7 细胞。

    ③ 处理细胞：细胞培养 48 小时后，裂解细胞并加入荧光素底物。

    ④ 测定荧光素酶活性： 测定萤火虫荧光素酶活性，并以海肾荧光素酶 (renilla luciferase) 作为内参基因，进行标准化处理。

 

figure. rcn2 was regulated directly by the transcription factor yy1. [2]

d. schematic illustration of yy1 binding site on the wild type and mutant rcn2 promotor. fluorescence activity in huh7 cells with rcn2 wildtype and mutant promotor with yy1 pcdna3.1.

 

实验结果：

    与空载体组相比，pcdna3.1-yy1 组的萤火虫荧光素酶活性显著升高，而 pcdna3.1-yy1-mut 组（突变 yy1 结合序列）的萤火虫荧光素酶活性没有明显变化。

该结果表明 yy1 能够直接结合 rcn2 启动子序列，并激活其转录活性，从而上调 rcn2 的表达

 

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参考文献：

1. lncrna hotair promotes the growth and metastasis of gastric cancer by sponging mir-1277-5p and upregulating col5a1. gastric cancer, 2020.
2. yy1-mediated reticulocalbin-2 upregulation promotes the hepatocellular carcinoma progression via activating myc signaling. am j cancer res, 2021.