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gst pull-down实验基于gst(glutathione-s-transferase),即谷胱甘肽-s-转移酶蛋白，可以与谷胱甘肽(glutathione,gsh)结合,将gsh固定于磁珠上,形成gsh-磁珠,将已知蛋白x与gst融合表达,获得的gst-x蛋白可与gsh-磁珠结合，若体系中存在与x蛋白互做的蛋白y,则会形成“磁珠-gsh-gst-x-y”复合物,与x蛋白互做的蛋白即可被分离并检测。

通过pull-down后wb验证发现,虽然可见目的条带,但是背景很高:

多方面原因造成:

1)实验仪器或试剂被污染,使用洁净的仪器及试剂。

2)转移膜上的目特异吸附导致背景高,实验操作过程中载手套,使用镊子来取,不要接触膜转移面。

3)制备样品中可能有不完全溶释的大的蛋白复合体,则在制备样品后进行知暂超声处理(3次,每次5秒钟),然后离心,取上清后进行后续试验。

4)洗涤不彻底,则需要多次洗涤,并设新增加洗涤液中的nacl和去垢剂浓度。

5)使用了过多的细胞或组织进行裂解导致背景高,则须减少样本量,推荐100-500ug细胞裂
解物。

6) 蛋白降解也可能出现高背景的情况,尽量使用新鲜制备的样品。

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