实验原理
rna pull-down是研究细胞内rna与蛋白/rna结合情况的技术。先将rna进行标记（如生物素标记），再与细胞裂解液共同孵育，从而形成rna-rna/蛋白质复合物，进而检测与之结合的rna或蛋白质。复合物洗脱后，通过荧光定量pcr（rna pull down- qpcr）或高通量测序（rna pull down-seq）方法来鉴定目标rna是否与某些rna分子相互作用，通过western blot（pull down-wb）实验和质谱（pull down-ms）技术检测目标rna是否与某些蛋白相互作⽤。
实验流程
试剂盒组分
常见问题
q1: 实验全程如何预防rna降解？
实验使用的所有试剂耗材需经过去rna酶处理。
q2：rna pull-down⼀定要体外转录合成rna探针吗？
体外转录只是获得rna的⼀种⽅式，相比化学合成纯度更高。所以pull-down实验⼀般是体外转录得到目的rna。当目的rna序列大于2000bp时体外转录就不太容易转录成功，这时我们可以设计合成⼀小段目的rna探针，通过探针与目的rna结合，再与蛋白结合，便可绕过这个问题。
q3：rna在转录出来后，其od⼀般都不高，可以使用吗？如何定量呢？
od值不高可进行rna纯化，即便不纯化在实验中多加⼀些rna亦可。而定量问题⼀般会进行琼脂糖凝胶电泳检测，可以根据marker浓度来判断rna的浓度。也可以用仪器测量rna的浓度，但通过体外转录得到的rna浓度都能达到2μg/ul以上。并且pull-down实验不需要精确的定量，都会加入过量的探针。
q4：关于样本处理，细胞或者组织裂解时要不要加蛋白酶抑制剂或rna酶抑制剂？还需要进行其他处理吗？操作过程中需要注意什么？
细胞裂解需要加⼊蛋白酶和rna酶抑制剂，最好能够进行超声处理。另外裂解蛋白的全程尽量在冰上操作。
q5：lncrna引物设计有什么注意事项？或者说与普通的引物设计有什么区别？
体外转录扩增的引物只需要在正向引物5’端加⼊t7启动子序列即可。
q6：质谱鉴定的蛋白主要是依据打分来进行筛选？这个筛选多少分算有效？
pull-down富集蛋白质谱分析后会剔除不可信蛋白，交付的都是可信蛋白，没有明确的打分。需要排序的话⼀般是根据鉴定蛋白特征性肽段的数目作为参考。
q7：做lncrnapull down 质谱⼀般都会发现多个互作蛋白对吗？如何选择哪一种蛋白继续研究下去？
不同的rna结合蛋白数量不等，根据实际鉴定的蛋白进行筛选；筛选的原则是根据自己研究的方向或相关功能确定这类蛋白。
