【客户文献解读，if＞11】食管癌的"隐形推手"：malr-凯发k8网页登录

    肿瘤相关巨噬细胞（tam）是肿瘤微环境中数量最多的免疫细胞，对肿瘤的发生发展起到重要调节作用。作者发现了一种与巨噬细胞相关的长非编码rna（lncrna），名为malr，它可以促进食管鳞状细胞癌（escc）的进展。tam通过分泌tnfa上调escc细胞中malr的表达，malr可以通过激活hif1a信号通路促进糖酵解和血管生成。在机制上，malr与ilf3的dsrbd1结构域结合，促进ilf3蛋白的稳定性以及由ilf3介导的液-液相分离（llps），从而防止parn介导的降解，提高hif1a mrna的稳定性。如果malr缺失，基于细胞系的以及患者来源的异种移植肿瘤的生长会被抑制。在临床上，malr的高表达与hif1a靶基因的表达正相关，并预示着食管癌患者的预后不良。总的来说，这项研究揭示了malr/ilf3介导的llps在肿瘤微环境重塑中的生理作用，突出了malr-ilf3-hif1a轴作为癌症治疗的潜在靶点。

  01  tams通过tnfa信号通路上调malr的表达  
 

    作者首先从与tams共培养的escc细胞中分离rna，并进行rna-seq分析以确定tam上调的lncrna。通过比较与tams共培养的escc细胞和单独培养的escc细胞，确定了前20个tam上调的lncrna（图1a）。为了进一步缩小候选者范围，作者对escc肿瘤组织与其配对的正常组织（n=20）进行了rna-seq分析，并确定了前20个在肿瘤组织中上调的lncrna（图1b）。在上调的lncrna中，只有一个候选者在两组中均出现，这个lncrna被命名为malr。

    通过qrt-pcr分析，证实了malr在escc组织（图1c）以及与来自患者的tams、m2型巨噬细胞或thp-1细胞共培养的escc细胞（kyse150和te-11）中上调（图1d-f）。相关性分析显示，escc肿瘤组织中malr的表达与cd68的表达呈正相关，cd68被认为是巨噬细胞的一种特异性标记（图1g）。此外，escc患者中malr高表达者总体生存率和无病生存率较差（图1h和i），这表明malr是escc潜在的预后生物标志物。此外，当与tnfa敲低的tams共培养或用中和抗体阻断tnfa时，肿瘤细胞中malr的上调没有发生显著变化（图1k；补充图s1i），这表明tnfa是导致tams诱导malr表达的主要炎症细胞因子。综上，这些结果表明tams通过tnfa信号通路上调malr的表达。

图1. malr通过tams分泌的tnfa上调

  02  malr通过激活hif1a通路促进escc细胞的恶性表型  

    考虑到malr可能参与escc的恶性发展，作者在两个高表达malr的细胞系中（te-15和te-9）构建了malr敲除（ko）的escc细胞，并进行了rna-seq分析以确定受malr调节的靶基因。热图结果表明，在两种escc细胞系中，当malr敲除后hif1a的表达显著下调（图2a）。据报道，hif1a在缺氧条件下调控许多基因以刺激糖酵解代谢和血管生成。对tcga数据的基因集富集分析表明，malr高表达与缺氧、糖酵解和血管生成呈正相关（图2b）。qrt-pcr分析显示，在缺氧条件下培养的malr敲除细胞中，hif1a靶基因的转录显著减少（图2c），这一点也得到了免疫印迹（ib）分析的证实（图2d）。这些数据表明malr在癌细胞中可能激活hif1a信号通路。

    malr的缺失显著削弱了escc细胞在缺氧条件下培养时的糖酵解活性和细胞生长（图2e和f；补充图s2b）。vegf是癌症中关键的促血管生成因子，对癌症进展至关重要。正如elisa所证实的那样，在缺氧条件下培养24小时后，malr的缺失显著降低了培养基中vegf的分泌（图2g）。此外，当人脐静脉内皮细胞（huvec）在从malr敲除细胞获得的培养基中培养时，管状形成能力显著受损（图2h）。tnfa刺激显著增强了escc细胞在缺氧条件下培养时的糖酵解活性、细胞生长和管状形成能力，而这种作用可被malr敲除所减弱（图2i-k）。综上所述，这些数据表明malr表达与hif1a激活之间存在强相关性，并强调了malr在重编程癌细胞代谢和促进血管生成中的潜在作用。

图2. malr通过激活hif1a通路促进escc细胞的恶性表型

03  ilf3与malr结合并经历llps  

    接下来，作者通过fish检测和malr的亚细胞定位发现malr主要定位于细胞核（图3a和b；补充图s3a）。为了探究malr在肿瘤进展中的潜在作用和机制，作者进行了rna pull-down分析，随后通过ms鉴定了与malr相关的蛋白质，如之前报道的那样，特异性与ilf3结合是正义malr，而不是反义malr（图3c）。malr与ilf3之间的特异性相互作用也通过rip实验得到证实（图3d；补充图s3b）。进一步的mtrap实验表明，与阴性对照相比，ms2-malr和mcp-3flag质粒的共表达导致ilf3的明显富集（图3e）。作者还通过chirp分析在体内验证了malr与ilf3的相互作用（图3f）。

    此外，作者进行了clip-pcr分析，并鉴定了malr的t3片段介导了malr与ilf3的相互作用（图3g）。通过进行ilf3蛋白序列的生物信息学分析，作者发现ilf3的c端高度无序，并包含idrs（图3h）。研究表明idrs经常出现在相分离的隔室中，因此作者推测ilf3分子有可能发生llps。为了评估与malr的相互作用是否诱导ilf3发生llps，作者将egfp-ilf3蛋白（绿色）与alexa fluor 546-14-utp标记的malr（红色）混合。混合后，ilf3和malr形成了微米大小的液滴（图3i），这在escc细胞中通过fish和if检测也观察到了（图3j）。frap分析进一步证明了ilf3介导的llps的动力学特性（图3k；补充影像s1）。如frap分析所示，液滴动态地改变，分子在液滴与周围溶液之间进行交换（图3k；补充影像s1）。综上所述，这些结果表明ilf3蛋白能够发生llps。

图3. ilf3与malr结合并经历llps

  04  malr促进ilf3蛋白的稳定性和ilf3介导的llps  

    随后，作者评估了malr-ilf3相互作用对ilf3稳定性的功能效应。作者发现在escc细胞与巨噬细胞共培养或用tnfa处理后，ilf3的表达增加（图4a；补充图s4a）。具体来说，malr ko escc细胞中ilf3的表达明显减少，但通过蛋白酶体抑制剂mg-132处理可以恢复（图4b），这表明malr促进ilf3的稳定性。此外，敲除malr对escc细胞中ilf3的稳定性有显著影响，缩短了escc细胞中ilf3的半衰期（图4c和d；补充图s4b）。此外，作者在用flag标签标记的ilf3表达的细胞中进行了ip试验，用抗flag抗体进行ip检测，并通过ib法检测了泛素水平。结果显示，malr敲除显著增加了泛素化ilf3的水平（图4e）。这些数据表明，malr是维持ilf3稳定所必需的。为了找出与malr相互作用所需的ilf3蛋白的结构域，作者测试了几种截短的ilf3蛋白形式并发现ilf3的dsrbd1片段在te-9细胞中是必需的（图4f）。综上所述，ilf3的dsrbd1片段是malr-ilf3相互作用和包括ilf3蛋白稳定性、细胞生长在内的关键功能所必需的。

    之前的研究表明，spop是一种e3泛素连接酶，通过与dsrbd1片段附近的结构域的物理相互作用来调节ilf3蛋白的稳定性。基于这一发现，作者通过co-ip实验观察到敲除malr显著增强了ilf3与spop之间的相互作用（图4g），这一结果也得到了duolink pla实验的证实（图4h；补充图s4h）。因此，作者的数据表明malr通过阻止spop介导的泛素化来增加ilf3蛋白的稳定性。当ilf3-egfp蛋白浓度为0.1mmol/l时，在不存在malr的情况下观察到了液滴的形成（图4i）。此外，正交实验表明ilf3的相分离依赖于malr的剂量。在存在malr的情况下，相同蛋白浓度下液滴形成能力显著增强（图4i）。为了进一步探讨malr对ilf3相分离的影响，作者在escc细胞中过表达malr，发现显著增加了ilf3点状形成（图4j）。malr ko escc细胞中ilf3点状形成受到抑制，这可以通过重新表达fl-malr来挽救，而在dt3-malr过表达组中则不是这样（图4k）。这些结果表明，malr（尤其是t3片段）促进ilf3介导的llps形成并促进肿瘤生长。

图4. malr促进ilf3蛋白的稳定性和ilf3介导的llps

  05  malr-ilf3介导的llps增加了hif1a mrna的稳定性  

    actinomycin d是一种广泛用于测量mrna降解率的转录抑制剂，在escc细胞中，malr的缺失降低了hif1a mrna的稳定性，而在这些细胞中加入actinomycin d（图5a；补充图s5b）后也是如此。相反，tnfa处理显著增强了hif1a mrna的稳定性，这可以通过在escc细胞中敲除malr来挽救（图5b；补充图s5c）。此外，在malr ko escc细胞中，hif1a mrna的稳定性降低可以通过外源性表达wt-ilf3来挽救，但不能通过didr-ilf3或ddsrbd1-ilf3来挽救（图5c；补充图s5d）。在malr ko细胞中，hif1a mrna的稳定性降低不能通过与1,6-hd一起使用的wt-ilf3来挽救，却可以通过与对照2,5-hd处理一起使用的wt-ilf3来挽救（图5d；补充图s5e和s5f）。综上所述，这些数据表明malr-ilf3介导的llps在促进hif1a mrna稳定性方面起着至关重要的作用。

    如图5e所示，作者推断ilf3介导的llps可能阻止hif1a mrna与parn之间的相互作用。敲除malr显著增加了hif1a mrna与parn的相互作用，这通过rip-pcr测定得到证实（图5f）。作者进一步测试了ilf3 ko escc细胞中hif1a mrna与parn的相互作用，rip-pcr测定表明，敲除ilf3显著增强了hif1a mrna与parn的相互作用，这可以通过在escc细胞中过表达shrna抗性的wt-ilf3来挽救，但不能通过过表达didr-ilf3或用1,6-hd处理来挽救（图5g）。总的来说，这些数据表明，malr-ilf3介导的llps通过防止parn介导的识别和衰变来维持hif1a mrna的稳定性。

    为了进一步研究malr促进的ilf3相分离对肿瘤细胞恶性行为的影响，作者在malr ko escc细胞中过表达了wt-ilf3或didr-ilf3（图5h）。作者发现，在缺氧条件下培养的malr敲除细胞中，wt-ilf3的过表达显著挽救了hif1a下游分子表达、ilf3点状形成、糖酵解活性、细胞生长和管状形成，但在didr-ilf3过表达组中则不是这样（图5h-l）。这些结果表明，malr-ilf3介导的llps促进escc的体外恶性进展。

图5. malr-ilf3介导的llps维持了hif1a mrna的稳定性

  06  malr-ilf3介导的llps促进escc的恶性进展  
    接下来，作者研究了malr-ilf3-hif1a轴在体内肿瘤发生中的作用。如图6所示，在escc细胞中下调malr或ilf3显著降低了基于细胞的异种移植肿瘤的生长（图6a和b；补充图s6a和s6b）。此外，ki-67和cd31（内皮细胞标记）也表明，细胞增殖和血管生成也减少（图6c；补充图s6c）。作者通过ihc和if染色检测还证实，在异种移植肿瘤组织中，hif1a表达和ilf3点状形成在malr或ilf3敲除后显著减少（图6c；补充图s6c）。这些数据与作者在体外的发现一致。作者按照先前报道的方法将escc细胞和巨噬细胞注射到nsg小鼠中，增加了异种移植肿瘤的生长、增殖、血管生成和ilf3点状形成，这可以通过在巨噬细胞中消耗tnfa以及在escc细胞中消耗malr或ilf3来消除（图6a-c；补充图s6a-s6c）。值得注意的是，使用malr抑制剂敲除malr可显著降低肿瘤生长、血管生成和ilf3点状形成（图6d-h；补充图s6f）。综上所述，这些结果表明malr在escc发展中具有促肿瘤作用。

图6. malr-ilf3介导的llps促进体内肿瘤生长

  07  escc患者中malr-ilf3-hif1a轴的临床相关性  

    为了确定malr及其上游或下游基因的表达与临床的相关性，作者检查了人类escc组织中的它们的表达谱。通过qrt-pcr检测了malr的表达，并根据中位数表达水平将样本分为malr-low和malr-high组。作者进一步通过ihc分析在escc组织队列中检查了malr与tam标记物（cd68）、肿瘤细胞增殖标记物（ki-67）和血管生成标记物（cd31）的表达水平之间的相关性（图7a）。malr-high组表现出较高的cd68、ilf3、hif1a、ki-67和cd31表达，而malr-low组表现出相反的模式（图7b）。值得注意的是，malr的表达与escc组织中ilf3点状的数量呈正相关（图7c）。此外，malr的表达与hif1a及其下游基因在escc样本中的表达呈正相关（图7d和e）。总之，这些数据表明malr-ilf3-hif1a轴在人类癌症的发展中起着重要的作用（图7f）。

图7. escc患者中malr-ilf3-hif1a轴的临床相关性

    本研究发现lncrna malr在食管癌中发挥关键作用。tams通过分泌tnfa上调malr，进而促进糖酵解和血管生成。malr与ilf3结合增强hif1a信号通路，促进肿瘤进展。在临床样本中，malr的高表达与不良预后相关。因此，malr-ilf3-hif1a轴可能成为治疗食管癌的潜在靶点。