【客户文章分享】shmt2 通过 5′utr 依赖性 adam10 翻译启动介导小分子诱导的阿尔茨海默病病理学缓解过程-凯发k8网页登录

    长期以来，人们一直认为一碳代谢（ocm）与阿尔茨海默病（ad）相关，但潜在的机制仍然不明确。利用化学生物学的优势，作者发现线粒体丝氨酸羟甲基转移酶2（shmt2）直接调节adam金属蛋白酶结构域10（adam10）的翻译，后者是ad的治疗靶点。发现小分子kenpaullone（ken）通过5'utr促进adam10的翻译，并改善app/ps1小鼠的认知功能。shmt2作为ken的靶基因和5'utr相互作用的rna结合蛋白（rbp）介导了ken诱导的adam10在体内外的翻译。shmt2通过与大量rna结合控制ad信号通路，并通过与gaggg基序直接相互作用增强adam10的5'utr活性，而这个基序影响了5'utr中的核糖体扫描。综上所述，ken通过将ocm与rna处理联系起来，展现了治疗ad的潜力，在这一过程中，代谢酶shmt2通过结合gaggg基序并促进5'utr依赖的adam10翻译起始，起到了“双重身份”的作用。

研究方法与结果

  01、ken增加了人类和小鼠细胞中的adam10表达

    ken已被证实可调节线粒体中parkin的招募，预防听力损失，并增加神经元分化，延长运动神经元的健康寿命。虽然这种分子似乎具有抗癌活性，但在神经退行性疾病中也具有抗凋亡作用。作者首先在sh-sy5y细胞中测量了adam10蛋白水平，发现ken在0.5至2μm浓度下显著增加了m-adam10的表达。进一步研究显示，这种效应不是由于ken抑制cdks和gsk-3引起的。而且，ken还在人类和小鼠细胞中增强了adam10蛋白水平，且不引起明显细胞毒性。免疫荧光图像显示，ken显著增加了sh-sy5y细胞中adam10蛋白的表达水平。此外，ken还使aβ42水平显著降低，表明ken增强的adam10在aβ的产生中具有功能作用。

图1: kenpaullone（ken）增加了人类和小鼠细胞中的adam10蛋白水平

  02、ken介导的adam10增强依赖于5'utr

    ken导致adam10增强可能是由于转录、翻译或蛋白质降解的改变，因此作者首先在sh-sy5y细胞中测量了mrna水平。如图2a所示，ken并未改变adam10 mrna水平。转录抑制剂放线菌素d（actd）或蛋白质合成抑制剂环己亚胺（chx）单独导致adam10蛋白水平降低，而ken诱导的adam10增强在chx存在时减弱，但在actd存在时没有减弱（图2b），表明涉及蛋白质合成。看来蛋白质降解机制不涉及这种调节，因为蛋白酶体抑制剂mg132或溶酶体抑制剂氯喹（cq）未能阻止ken介导的adam10增强（图2c）。此外，作者排除了cdks/gsk-3在adam10调节中的作用，因为单独沉默cdk5或gsk-3β并不改变基础条件下的adam10蛋白，并且未能进一步阻止ken诱导的adam10蛋白水平增强（图2d,e）。因此，作者接下来评估了翻译机制是否介导了ken的效应。如图2f所示，翻译抑制剂4egi1，它破坏了真核翻译起始因子e（eif4e）-eif4g相互作用，显著降低了adam10蛋白的基础水平，并进一步减弱了ken对adam10的增强作用。通过转染adam10构建，其中包括或删除了5'utr，作者发现5'utr的缺失明显增强了adam10的基础水平，如先前报道的那样，并且在−5'utr但不是在 5'utr中ken诱导的adam10增强被减弱（图2g）。进一步的5'utr-荧光酶分析显示核苷酸1–144和145–414足以介导ken的功能（图2h），而bace1的5'utr活性未发生改变（图2i），这阐明了对adam10的选择性调节。这些结果表明ken通过5'utr诱导adam10的翻译。

图2. ken诱导的adam10翻译依赖于5'utr

  03、ken促进了app/ps1小鼠中adam10的表达并改善了认知缺陷

    作者接下来确定增强的adam10表达是否与体内淀粉样蛋白生成和认知功能的改变相关联（见图3a）。野生型（wt）和app/ps1小鼠被腹腔注射给予对照组（crtl）或ken，从而产生了以下四个组：wt、wt-ken、app/ps1和app/ps1-ken。鉴于ken是cdk和gsk-3的抑制剂，这些蛋白激酶已知在选择性位点包括ser262（tau262）和ser396（tau396）上磷酸化tau，而这些磷酸化位点在app/ps1小鼠的大脑中升高。因此，通过测量tau262/396水平可以验证ken在大脑中的有效性。此外，adam10的底物之一，神经胶质相关细胞粘附分子（nrcam），用于评估adam10激活剂的副作用。如图3b所示，相对于app/ps1小鼠，app/ps1-ken的tau262/396蛋白水平显著降低，表明ken成功到达大脑并发挥了生物功能。adam10和sapp的蛋白水平在wt和app/ps1小鼠中均显著升高，而nrcam的水平未显著升高，表明ken选择性地增强了adam10而避免了与神经突触生长相关的副作用。作者进一步显示在ken治疗的app/ps1小鼠中，adam10蛋白水平的增强伴随着aβ沉积的减少。为了确定ken是否会影响认知功能，作者使用水迷宫测试和上下文恐惧条件测试评估了app/ps1小鼠的空间和联想学习记忆。在隐藏平台测试中，app/ps1-ken小鼠的逃避潜伏期显著短于app/ps1小鼠，从第三天开始（见图3e）。在探索试验中，当移除平台时，app/ps1-ken小鼠在目标象限停留的时间（见图3f）和穿越目标位置的通过时间（见图3g）显著长于app/ps1小鼠，表明ken改善了空间记忆（见图3h）。随后的上下文恐惧条件测试显示，在app/ps1-ken小鼠中，冻结的次数（冻结次数）显著增加，冻结的持续时间（冻结时间）显著延长，与app/ps1小鼠相比（见图3i、j）。wt和wt-ken之间未观察到显著差异。这些结果表明ken显著改善了app/ps1小鼠的空间和联想学习记忆。

图3. ken增强了adam10并拯救了app/ps1小鼠的认知缺陷

  04、shmt2是ken和5'utr相互作用rna结合蛋白的靶基因

    为进一步理解ken诱导的adam10翻译的潜在机制，作者在sh-sy5y-app细胞中通过rna-seq评估了不同调节的基因（degs），其中aβ过度产生，从而在ad样病理中重塑淀粉样形成。作者构建了共表达网络，以找到在有无ken的情况下基因之间的关系。ken诱导了共计733个degs，包括296个上调和437个下调的基因。上调的通路包括氨基酰-trna生物合成、氨基酸生物合成、碳代谢和叶酸一碳池。重要的是，shmt2被确定为线粒体ocm中的中心基因。5'utr的依赖性促使作者推测一些degs可能也作为rbps在调节adam10翻译中发挥作用。因此，作者进行了一个rna结合实验，其中adam10的5'utr被5-溴尿嘧啶标记。作者发现在控制和ken的情况下有两组rbps。进一步的蛋白质相互作用分析结果显示，shmt2与经典的rbps和核糖体蛋白相互作用。shmt2与ybx1和csde1的相互作用以及5'utr的进一步验证，说明了shmt2是靶向5'utr的rbp网络的关键组成部分。western blotting实验证实，shmt2蛋白水平受ken剂量依赖性显著增加，并且shmt2敲除阻断了ken诱导的adam10表达增强。进一步的实验表明，干扰shmt2或5'utr的小分子破坏了ken诱导的adam10翻译的调节。

图4. shmt2 是 ken 和与 5′utr 相互作用的 rbp 的靶基因

  05、shmt2敲除减弱了ken对app/ps1小鼠中adam10和认知功能的影响

    作者接着确定了shmt2是否也介导了ken对adam10和淀粉样物质生成的影响。作者在app/ps1小鼠的海马区双侧注射病毒aav载体（对照组）或aav-shshmt2，在没有ken（aav-shshmt2-对照组）和有ken（aav-shshmt2-ken）的情况下，评估了与aβ负荷和记忆功能相关的adam10蛋白水平。如图5a所示，shmt2蛋白水平的显著降低同时伴随着adam10和sapp水平的显著降低；当shmt2被沉默时，ken未能有效增强adam10/sapp。此外，shmt2的沉默显著增加了海马区aβ的数量和强度，以及aβ40/42水平，而这些变化不受ken的影响（图5b、c）。进一步的行为测试显示，单独shmt2的沉默显著损害了空间和客观记忆，而额外的ken未能引起进一步的行为改变（图5d-k）。这些结果表明，在app/ps1小鼠中，ken诱导的对adam10、淀粉样物质生成和认知功能的调控是通过shmt2介导的。

图5. 敲除 shmt2 可减轻 ken 对 adam10 和 app/ps1 小鼠认知功能的影响

  06、shmt2结合了大量与ad和ken的细胞功能密切相关的rna

    rna结合特性表明shmt2除了其酶活性外，还可以通过rna处理来调节细胞功能。因此，作者在sh-sy5y细胞中使用针对内源性shmt2的抗体进行了rip-seq。如图6a所示，shmt2在对照组和ken处理组中分别招募了6266和6874个转录本（补充表rip-seq）。利用meme程序进行的5226个在两组中常见的rna的基序分析显示，shmt2倾向于与富含ga和gc的基序相互作用（图6a）。重要的是，两组中的kegg通路均包括核糖体、ad以及多种疾病的神经退行性变化（图6b）。ken特异性地影响了3401个转录本，包括那些仅在对照组或ken中独特存在，并且在两组中都被ken改变；kegg分析显示了代谢途径和碳代谢与shmt2功能一致，而其他通路包括rna转运也被包括在内（图6c）。由于rna-蛋白相互作用调节了rna处理，作者推测shmt2靶向的部分rna可能会对ken诱导的细胞功能变化发挥作用。利用ken的degs数据（图4a,b），作者评估了在ken处理细胞中发生改变的shmt2靶向mrna。综合分析显示有112个基因重叠（图6d），go分析显示转录因子活性和重要的翻译起始因子活性受到影响，表明shmt2结合的rna丰度子集特别受到ken的调节。这些结果表明，shmt2通过优先与富含ga/gc的序列相互作用，作为rbp发挥作用，这些序列与ad以及ken的细胞功能密切相关。

图6. shmt2靶向的rna参与了ad和ken的细胞功能

  07、shmt2通过直接结合gaggg基序来控制5′utr活性

    为验证shmt2是否直接结合rna并发挥其功能，作者使用adam10 mrna的5′utr不同片段进行电泳迁移实验（emsa）。如图7a所示，人类全长5′utr包含多个gaggg/gaaag序列，位置已标示。重组的shmt2蛋白由小泛素样修饰物（sumo）标记，单独的sumo不结合任何这些片段（图7b）。shmt2仅结合包含gaggg/gaaag的片段，分别为69–90、156–175、176–200、201–222和223–244。相反，在rna片段不包括gaggg/gaaag基序时，rna-蛋白复合物（rpc）缺失（图7b）。此外，当对应编号的片段中gaggg/gaaag基序发生突变时，未发现rpc（图7c）。作者进一步展示，在100倍过量的非标记rna存在时，rpc密度显著降低（图7d）。由于ken还增强了小鼠细胞系和原代神经元中的adam10表达（图1），因此作者随后评估了小鼠来源的shmt2-5′utr结合。如图7e所示，223nt长的小鼠5′utr（nm_007399）包含多个gaggg但不含gaaag基序。sumo标记的小鼠shmt2仅结合包含gaggg的片段1–29和30–57，而不结合不含gaggg的片段58–86；而单独的sumo不结合这些片段。为进一步确认shmt2是否控制了5′utr的功能，作者评估了hek细胞中shmt2 sirna的转染后5′utr活性。如图7f所示，shmt2敲除显著降低了人类5′utr的荧光素活性，并显著减弱了ken诱导的增强效应。这些结果表明，shmt2直接结合了人类和小鼠来源的gaggg基序，并调节了5′utr的活性。

图7. shmt2 与 gaggg 基序结合并控制 5′utr 活性

  08、gaggg突变影响了eif2的核糖体扫描

    shmt2偏好于gaggg模体表明cis元素在调控rna功能中很重要，尤其是adam10的5'utr活性方面。为了弄清楚gaggg模体在5'utr功能中的作用，作者将adam10 5'utr中位于26和56核苷酸处的野生型gaggg突变为gauug（mut-adam10 5'utr），并将其克隆到荧光素报告基因构建中。作者预测了相应的二级结构。相比于对照，mut-adam10 5'utr显示出了更高的自由能。令人惊讶的是，gaggg突变（mut-gaggg）导致5'utr的荧光素活性显著增强。作者进一步评估了敲除eif2s1/2后的5'utr luciferase活性，结果显示mut-gaggg的活性仍然显著增加，表明gaggg模体的突变使得rna结构发生变化，从而增强了核糖体的扫描。综上所述，gaggg模体的存在与rna结构和翻译效率密切相关，shmt2与gaggg模体的结合可能改变rna结构，促进adam10的翻译，从而减少淀粉样蛋白生成。

图8. gaggg 突变缓解了 eif2 敲除对 5′utr 活性的抑制

结论

    本研究揭示了shmt2在调节与ad相关的rna修饰中的作用，尤其是在ken对adam10 5'utr活性的影响中的介导作用。然而，shmt2在调节多种生物学途径方面的多面作用不支持将ken-shmt2的关联作为治疗ad的可能途径，减少淀粉样生成只是shmt2多种效应之一。此外，ken在动物模型中改善的认知功能也涉及到对tau病理的减少，这可能与shmt2无关，因为ken是已知的gsk和cdk的抑制剂，这些激酶被认为是磷酸化tau的。shmt2在ad病理生理学中的详细功能仍有待进一步澄清。

    在本文中，重组shmt2蛋白由金开瑞生物提供。