基因调控 -凯发k8网页登录
研究基因调控对于揭示生物体内复杂生命活动的调节机制至关重要。了解基因如何被调控,对于理解发育、疾病发生和治疗等方面具有重大意义。基因调控研究依赖于多种实验技术,其中,双荧光素酶报告基因实验是一项重要的工具。
通过构建含有荧光素酶报告基因的表达载体,研究者能够观察基因调控因子对荧光素酶活性的影响,实现实时、定量的基因表达监测。这项技术的独特之处在于其高度灵敏性和快速响应性,使得研究者能够准确地探究基因的表达水平和调控机制,为新药研发和疾病治疗提供了有力支持。下面让我们一起来深入了解这一引人注目的技术——双荧光素酶报告基因实验。
一、技术简介
• 双荧光素酶检测是转录调控研究中十分重要的实验手段,主要应用于启动子和转录因子,以及mirna和其靶基因互作的验证。
• 在双荧光素酶检测中,将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因,海肾荧光素酶作为对照报告基因。实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达,而对照报告基因作为内对照。
• 以荧光素为底物来检测萤火虫荧光素酶活性,荧光素酶可以催化荧光素,在荧光素氧化的过程中会发出生物荧光,然后通过化学发光仪测定。
二、原理简介
1.转录因子与启动子
将启动子序列构建到萤火虫荧光素酶基因前,同时过表达转录因子。当转录因子与启动子上特异结合位点结合后激活荧光素酶基因转录,使萤火虫荧光素酶得以表达,最终荧光强度上升;当结合位点被突变后,转录因子无法与启动子结合,因此荧光值无明显变化。
2.mirna与靶基因
将靶基因序列构建到萤火虫荧光素酶基因3'区域,同时过表达microrna。当microrna与靶基因上特异结合位点结合后,将干扰荧光素酶mrna的翻译或导致其迅速降解,使荧光强度降低;当结合位点被突变后,microrna无法与靶基因结合,因此荧光值无明显变化。
三、实验流程
1、确认mirna和靶基因相关信息,或者软件预测mirna和靶基因结合位点
2、基因合成靶基因3'utr序列或者突变位点,将该片段构建到萤火虫报告基因载体,测序验证
3、基因合成pre-mirna序列,将该片段构建到cdna3.1载体,测序验证。或使用合成的mimic进行实验
4、将报告基因质粒转录因子与pre-mirna表达质粒共转染目标细胞 (建议使用293t细胞进行实验,因为细胞种类会极大影响培养和转染难度)
5、裂解细胞提取蛋白并用于荧光素酶检测
6、加入酶作用底物,化学发光仪测定荧光素酶的活性
7、数据计算及结果分析(实验组荧光强度低于对照组即为阳性结果)
四、常见问题及解析
问题1:在双荧光素酶报告基因实验中,为什么我的荧光信号弱,无法检测到有效的结果?
凯发k8网页登录的解决方案:这可能是由于底物浓度不足或酶反应时间过短所致。建议增加底物的浓度或者延长酶反应时间,确保足够的信号被产生。
问题2:为什么我的背景荧光信号过高,影响了实验结果的准确性?
凯发k8网页登录的解决方案:高背景信号可能是由于试剂或底物受到污染所致。请确保在实验操作中使用无菌和纯净的试剂,并尽量避免交叉污染。此外,优化底物的浓度和酶反应时间也可以帮助降低背景信号。
问题3:在实验中,为什么观察到的荧光信号不稳定,波动较大?
凯发k8网页登录的解决方案:荧光信号的不稳定性可能与温度、光照条件或仪器设置有关。请确保在实验过程中保持恒定的温度和光照条件,并校准实验仪器以确保准确的信号读数。
问题4:我在实验中使用的底物浓度很高,为什么荧光信号仍然不够强?
凯发k8网页登录的解决方案:荧光信号不足可能是由于底物的降解或酶的失活所致。建议检查底物的新鲜度并避免长时间的储存。另外,可以尝试使用更稳定的酶或者增加酶的浓度来提高信号强度。
问题5:在双荧光素酶报告基因实验中,如何避免样本之间的批次效应?
凯发k8网页登录的解决方案:为了避免批次效应,建议在实验中使用相同批次的试剂和底物。同时,保持实验条件的一致性,包括操作者、实验仪器和操作步骤,也是非常重要的。定期进行质控实验,确保数据的可靠性和稳定性。
五、金开瑞近期合作案例展示
发表期刊:international journal of nanomedicine
影响因子:8
合作技术:双荧光素酶报告基因
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