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1.从文库构建来说： （1） 文库构建方式灵活：根据样本的类型，提供的样本量等方面考虑，可采用smart，geteway，infusion体外重组和t4体外连接等方式进行文库构建； （2） 文库片段大小可控：根据客户想要研究的蛋白类型大小控制片段的大小，以提高筛选到目标蛋白的可能性。如白细胞介素，生长因子类的小分子蛋白；转录因子，信号通路类的分子量稍大一些的蛋白； （3） 单双杂文库通用：构建一种类型的文库，可同时用于单双杂筛选； 2.对于文库筛选来说： （1）筛库方式多样：可采用mating或共转的方式进行文库筛选； （2）互作强弱可控化：提高（降低）筛选压力，用于筛选出强（弱）相互作用的蛋白。 （3）阳性结果进一步验证：文库筛选出的阳性结果，可进行点对点验证进一步排除假阳性。

主要凯发娱发k8官网的业务范围如下： 1.核酵母单/双杂文库构建； 2.膜酵母双杂交文库构建； 3.核酵母单/双杂文库筛选； 4.膜酵母双杂交文库； 5.核酵母单/双杂点对点验证； 6.膜酵母双杂交点对点验证。

（1）his3。y2hgold不能合成组氨酸，因此不能在缺乏这种必需氨基酸的培养基上生长。当诱饵和猎物蛋白质相互作用时，gal4-responsive his3的表达允许细胞生物合成组氨酸并在其最小的培养基上生长.可添加3’at进行背景抑制。 （2）ade2。y2hgold也不能在不含腺嘌呤的最小培养基上生长。然而，当两种蛋白质相互作用时，ade2表达被激活，使这些细胞在ade最小培养基上生长。 （3）mel1。mel-1编码-半乳糖苷酶，一种在许多酵母菌中自然存在的酶。由于双杂交相互作用，α-galactosidase (mel1)由酵母细胞表达和分泌。表达mel1的酵母菌落在致变色底物x-α-gal存在下变成蓝色。 （4）aur1-c，aur1基因的一个显性突变版本，编码肌醇磷酸化神经酰胺syn- thase酶。aur1-c在y2hgold酵母株中表达，是由于蛋白质与蛋白质的相互作用，使gal4转录激活和dna结合域接近。可以添加aba进行背景抑制。, pabai载体携带ura3基因，pgadt7载体携带leu基因，pgbkt7载体携带trp基因, 筛选所用到的平板：一缺：sd/- ura， sd/- leu / aba ； 二缺：ddo[sd/-leu/-trp]， ddo/x[sd/-leu/-trp/x-α-gal] ； 三缺：tdo [sd/-leu/-trp/his3]； 四缺：qdo[sd/-leu/-trp/-his3/-ade2]

（1）pgbkt7载体用于构建核酵母双杂bait-pgbkt7质粒或作空白对照。 （2）pgadt7载体用于构建核酵母双杂，单杂prey-pgadt7质粒或作空白对照。 （3）pabai 载体用于构建单杂bait-pabai质粒。 （4）pgbkt7-53质粒与pgadt7-t质粒作为核酵母双杂验证和筛选的阳性对照组。 （5）pgbkt7-lam质粒与pgadt7-t质粒作为核酵母双杂验证和筛选的阴性对照组 （6）post1-nubi 质粒与pbt3-n-bait质粒作为膜酵母双杂交验证和筛选的功能验证对照组； （7）pbt3-n载体用于构建n端位于胞质，c端位于细胞器腔内（或者胞外）诱饵蛋白； （8）pbt3-suc载体用于构建n端位于细胞器腔内（或者胞外），且n端含有信号肽的诱饵蛋白； （9）pbt3-ste载体用于构建c端位于胞质，n端位于细胞器腔内（或者胞外），且n端不含信号肽的诱饵蛋白； （10）pbt3-n和pbt3-ste皆可n端c端均位于胞质的诱饵蛋白； （11）ppr3-c载体用于c端位于胞质，n端位于胞外或细胞器腔的猎物蛋白构建； （12）ppr3-n载体用于膜文库构建和不跨膜的猎物蛋白构建； （13）ptsu2-app质粒和pnubg-fe65质粒作为膜酵母双杂验证和筛选的阳性对照组； （14）ptsu2-app质粒和ppr3-n质粒作为膜酵母双杂验证和筛选的阴性对照组 （15）y187菌株：clontech公司开发的gal4系统酵母单杂，双杂实验用菌株，matα型，可直接转化质粒或与mata型酵母菌株（y2hgold，ah109等）通过mating操作进行筛库试验。缺陷 trp1, leu2，报告基因为：lacz, mel1。 （16）y1hgold菌株：clontech公司开发的gal4-aba酵母单杂系统用菌株，matα型，可直接转化质粒进行筛库试验。缺陷 ura3，leu2；报告基因为：abar。 （17）y2hgold菌株：clontech公司开发的gal4系统酵母双杂实验用菌株，mata型，可直接转化质粒或与matα型酵母菌株y187通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。transformation  marker为: trp1, leu2，报告基因为：abar, his3, ade2, mel1。 （18）nmy51菌株:dualsystems biotech公司开发的检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂实验用菌株，可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验；此菌株缺陷 trp1, leu2-3，报告基因为：his3, ade2 和 lacz

建库：总rna提取——mrna分离及纯化——双链cdna合成及纯化——双链cdna与pgadt7载体体外连接——大肠文库菌液——文库质粒——转化y187酵母宿主——y187酵母文库菌液 双杂筛选：（1）matting方式：诱饵重组质粒pgbkt7载体构建——诱饵重组质粒和pgadt7空载转y2hgold酵母宿主进行自激活验证——含诱饵的y2hgold酵母菌液与y187酵母文库菌液进行混合——根据自激活结果涂布筛选平板——阳性结果点钟——阳性菌培养提质粒——pcr阳性鉴定——送测——测序结果分析 （2）共转：诱饵重组质粒pgbkt7载体构建——诱饵重组质粒和pgadt7空载转y2hgold酵母宿主进行自激活验证——文库质粒转化含诱饵的y2hgold酵母感受态——根据自激活结果涂布筛选平板——阳性结果点钟——阳性菌培养提质粒——pcr阳性鉴定——送测——测序结果分析 单杂筛选：诱饵重组质粒pabai载体构建——线性化诱饵重组质粒和pgadt7空载转化y1hgold酵母宿主进行自激活验证——文库质粒转化含诱饵的y1hgold酵母感受态——根据自激活结果涂布筛选平板——阳性结果点钟——阳性菌培养提质粒——pcr阳性鉴定——送测——测序结果分析

可以通过启动子序列分析查找，确定探针设计范围，如果范围太宽泛，可以先将0.5-1kb片段克隆到荧光素酶报告载体验证其启动子活性以及是否受到该转录因子调控；寻找核心启动子可以通过分段截断验证。如果研究的转录因子具有已知的结合序列motif，则可以在该motif位点选择探针。也可以先进行chip或dna pull down找到富集序列之后，再设计分段探针进行验证。

a.启动子结构分析，将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。 b.启动子snp分析，一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。 c.验证特定转录因子同其调控序列的作用，将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高荧光素酶活性。 d.可以分析信号通路是否激活，将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，荧光素酶活性代表了通路的下游响应。例如在gpcr研究中，将camp response element（cre）载入报告基因载体，构建稳定表达细胞株后，可以用于分析gprc的激活与抑制剂筛选。又如，将hif1α的响应原件hypoxia-responsive element (hre)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株，可以用于低氧相关通路的研究。 e.验证microrna的靶序列，将待测的3’utr序列插入报告基因载体，再共转入该microrna，如果荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。

luciferase的灵敏度相比于gfp提高10-100倍以上，同时具有更宽的动态范围，便于数值分析比较，不需要荧光显微镜，而且在活体实验中其荧光穿透性高于egfp等荧光蛋白，同时由于没有内源活性、其本底信号很低。 而gfp等荧光蛋白相比于荧光素酶的优势在于可以进行失踪定位，并且其观测不需裂解细胞，方便进行适时观察。

海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶相比，相对活性如何？ 在氧、镁和atp的存在下，萤火虫荧光素酶作用于萤火虫荧光素，而来源于海洋腔肠（renilla reniformis)的荧光素酶在氧的存在下作用于海肾荧光素。双报告基因技术（dual-reporter assays）,结合了萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试。