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q:测定了制品的od值后发现od260/od280<1.8,制品质量 (纯度) 合格吗?

由于核酸在260 nm附近有强吸收,而蛋白质在280 nm附近有强吸收,从生物体内提取核酸时,常用od260/od280比值来评价核酸纯度 (比值在1.8~2.0之间),这一判断是基于序列中a、g、c、t所占比例大致相同时的结果。而合成的dna/rna则不同,序列很短 (通常在20~30个碱基之间),其中a、g、c、t各种碱基所占比例很不相同,由于各种碱基的摩尔消光系数不同,因此不同碱基构成的合成dna/rna制品的od260/od280比值也不同,例如当序列中c、t碱基的含量高时,该比值会大大低于1.8。此外,序列中碱基的排列顺序也影响该比值。所以不能根据od260/od280比值来评价合成dna/rna制品的纯度。

q:使用3%的agarose凝胶电泳合成oligo dna制品,发现有很多条泳带,为什么?

oligo dna的电泳一定要使用变性page电泳。oligo dna是单链dna,容易形成复杂的立体结构,因此进行agarose电泳时,容易出现多条泳带 (更无法用agarose电泳进行定量了)。

q:进行page电泳时,长度完全一样的oligo dna为什么泳带不在同一位置?

a、g、c、t的组份不同,电泳速度不同; dna的立体结构不同,电泳速度不同。 这种情况在oligo dna越短时越容易发生,长链oligo dna之间差别越小。

q:一般的合成oligo dna的5' 和3' 末端有磷酸基团吗?

没有,5' 和3' 末端均为-oh基。如需要加磷酸基团,订货时请特别注明,此时需收取磷酸化 (po4修饰) 的费用。

q:能否根据电泳带的亮度对合成的dna/rna制品进行定量?

不能。 因为etbr是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的dna/rna分子为单链,只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构,才能被etbr染色。由于不同制品的序列不同,形成双螺旋的能力不同,因此染色能力不尽相同,也就不能根据etbr染色带的亮度来对合成的dna/rna进行定量。

q:引物片段退火后不能连接到载体上是什么原因?

连接反应的引物如果没有5’磷酸基团,连接效率相对较低,但不是完全不能成功。 如果磷酸化的产物还不能连接载体上,需要检查载体的酶切效果以及核对引物的设计方案,如果都没有问题就要考虑改善引物退火的条件以及连接反应体系。

q:贵公司可合成多长的dna,多长的rna?

合成dna的长度为6~130个碱基;合成rna的长度为8~35个碱基。当合成的dna序列较长时,由于合成及纯化方法的限制,很难保证制品中每个序列都正确无误。此外需要说明的是:如果待合成序列比较特殊 (例如多个“g”连续出现等),合成收率相对较低,我们可能会根据具体情况加收费用;有时我们也可能无法合成订购的序列,此时本公司保留不接受定单的权利。

q:合成的dna应如何保存?

干燥制品很稳定,-20℃下保存2年没问题。 溶解后的dna也请保存于-20℃,最好是分份保存,避免反复冻融。 溶液中的oligo dna在常温下放置3~4天应该没问题,但最好不要放置一个星期以上。其寿命与容器、溶剂的灭菌程度有关。

q:已经溶解的引物,为什么原先使用正常,而过一段时间再使用就不好了?

如果您溶解引物的水ph过低或污染了菌或核酸酶,会使引物降解。使用时没有充分解冻混合,液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物,避免反复冻溶。建议使用10mm tris ph7.5缓冲液溶解引物,因为有些蒸馏水的ph值比较低(ph4-5), 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题,而是pcr使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。

q:引物质量好坏的判断标准是什么?

合成的引物和您的定单序列一致,而不是能否扩增出您所需要的产物。

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