酵母双杂交实验|酵母双杂交系统|酵母表达载体 -凯发k8网页登录
- 核蛋白酵母双杂交
- 膜蛋白酵母双杂交
服务特色
金开瑞可提供酵母杂交文库构建、核酵母双杂交筛选、膜酵母双杂交筛选、酵母单/双杂交验证服务。
服务介绍
酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测蛋白质相互作用的研究方法，因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点，现已被应用于多个研究领域。
核蛋白酵母双杂交：
核蛋白酵母双杂交技术最初由fields等人在研究酵母转录因子gal4性质时建立，后续经过不断改进已发展成为一种成熟的蛋白-蛋白互作研究工具，具有简便、灵敏、可反映蛋白在活细胞内互作真实情况的特点，被广泛应用于互作蛋白的筛选、蛋白相互作用的鉴定/验证、蛋白互作机理的探究、蛋白连锁图谱绘制等工作。
膜蛋白酵母双杂交：
dualmembrane技术在传统的酵母双杂交系统的基础上，巧妙地利用分离的泛素系统(split-ubiquitin) 进行蛋白质相互作用的筛选；泛素作为降解信号分子，人为分成两部分：n端 (nub)，c端 (cub)，互补重构的完整泛素分子可被泛素专一性蛋白酶(ubps)识别，从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。
服务优势
- 一站式辅助检测手段方便快捷，得到可靠的实验结论；
- 多年文库构建经验，4种优化的total rna提取技术方案可以有效保证total rna的纯度和完整性，保证样本的多样性。
- 直接检测蛋白质之间的相互作用，而不依赖于其他分子或细胞的参与；
- 可同时筛选和鉴定多个蛋白质间的相互作用，实现高通量的筛选和分析；
- 采用多个筛选步骤，如报告基因的验证和酵母菌株的双重选择，可以减少非特异性相互作用的假阳性结果；
- 可通过报告基因的表达水平定量评估蛋白质相互作用的强度，进一步了解相互作用的动力学和功能。
服务说明
服务流程
酵⺟杂交⽂库构建：
酵母单杂交文库筛选
酵母杂交验证：
| 服务项目 | 应用 | 互补实验 |
| 酵⺟杂交⽂库构建 | 酵⺟杂交筛选 | / |
| 核酵⺟双杂交筛选 | 获得与已知蛋⽩互作的未知蛋⽩ | coip，gst pulldown |
| 膜酵⺟双杂交筛选 | 研究膜蛋⽩之间的互作 | coip，gst pulldown |
| 酵⺟单/双杂交验证 | 已知蛋⽩与蛋⽩/启动⼦之间的互作 | emsa，双荧光素酶，coip，gst pulldown |
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服务项目 |
客户提供 | 最终交付 |
| 文库构建 |
组织/细胞 |
滴度在1×10cfu/ml以上的酵母文库菌液；文库pcr鉴定结果图片(阳性率在90%左右) |
| 文库筛选 |
蛋白序列/基因序列/质粒 |
筛选过程中的全部原始图片；筛选获得所有相互作用的猎物蛋白的测序结果 |
案例展示
相关技术服务
相关资源
一、酵母双杂交技术与其他实验方法结合使用，进一步验证和深入研究相互作用的结果。以下是一些常见的与酵母双杂交技术结合使用的实验方法和技术：
● 共沉淀实验（co-immunoprecipitation）：通过共沉淀实验可以验证在酵母双杂交中发现的蛋白质相互作用是否在真实生物环境中发生。该实验通过特定抗体与目标蛋白质结合，并随后使用免疫沉淀技术将与其相互作用的蛋白质一起沉淀下来，以进一步证实相互作用的存在。
● 免疫荧光染色（immunofluorescence staining）：通过免疫荧光染色可以确定蛋白质相互作用的亚细胞定位和动态变化。该技术使用特定抗体与目标蛋白质结合，并通过荧光标记的二抗或荧光标记的蛋白质结合域来可视化相互作用的位置和形式。
● 酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, elisa）：elisa可以定量测定蛋白质之间的相互作用强度。通过将酵母细胞裂解提取的蛋白质与特定抗体结合，再用标记的二抗和酶底物进行检测，可以测定相互作用的强度。
● 蛋白质结构分析技术：例如x射线晶体学和核磁共振等技术，可以用于解析蛋白质相互作用的三维结构，进一步了解相互作用的机制和结构特征。
● 蛋白质组学分析：通过质谱技术（如质谱联用技术）可以鉴定和定量测定与目标蛋白质相互作用的蛋白质。这种方法可以提供更全面的蛋白质相互作用网络信息。
● 基因表达分析：通过基因表达分析方法（如实时定量pcr、rna测序等），可以确定与目标蛋白质相互作用的基因的表达水平的变化。这有助于了解蛋白质相互作用对基因调控的影响。
● 细胞荧光共定位分析：通过将荧光蛋白标记的蛋白质与目标蛋白质共表达，通过荧光显微镜观察它们在细胞中的共定位情况，可以进一步证实它们的相互作用。
● 组织特异性表达分析：通过组织特异性表达分析方法（如原位杂交、免疫组化等），可以确定与目标蛋白质相互作用的基因在不同组织中的表达模式，从而了解蛋白质相互作用的组织特异性。
● 代谢标记技术：通过代谢标记技术（如蛋白质生物素标记、蛋白质荧光标记等），可以跟踪和定量测定蛋白质相互作用的时空动态变化。
二、研究蛋白质之间相互作用的方法简介、应用场景、优劣势及优化建议
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方法 |
简介 |
应用场景 |
优劣势 |
优化建议 |
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酵母双杂交 （yeast two-hybrid） |
利用酵母细胞内的转录激活和检测系统， 筛选和鉴定蛋白质之间的相互作用 |
揭示蛋白质相互作用网络、调控机制、代谢途径等生物过程 |
优势：高通量筛选、生理相关性、定量分析能力； 限制：非自然环境、假阴性结果 |
选择适当的诱饵和猎物构建策略，优化培养条件， 使用高灵敏性检测系统进行验证， 增加筛选步骤和互补技术进行验证。 |
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（co-immunoprecipitation） |
利用特异性抗体富集目标蛋白质及其结合的互作伙伴 | 研究蛋白质复合物的组成、结构和功能 |
优势：生物相关性、较低的假阳性率、定性和定量分析能力； 限制：特异性抗体的选择、技术复杂性 |
选择合适的抗体，进行前处理步骤以减少非特异性结合， 使用对照实验验证结果，结合其他技术进行互补验证。 |
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表面等离子体共振 （surface plasmon resonance，spr） |
监测蛋白质结合到传感芯片表面的光学信号变化 | 评估蛋白质结合的动力学、亲和力和特异性 |
优势：高灵敏度、实时监测； 限制：设备和实验技术的要求 |
选择适当的传感芯片和结合条件，优化实验参数和流速， 增加对照实验和质控步骤，优化数据分析和解释。 |
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核磁共振 （nuclear magnetic resonance，nmr） |
通过测量核磁共振谱来研究蛋白质的结构和相互作用 | 研究蛋白质的折叠状态、结合界面和动态变化 |
优势：高分辨率、提供结构和动态信息； 限制：设备和技术要求、样品的制备和稳定性 |
选择适当的标记方式和溶剂条件，优化样品纯度和浓度， 选择适当的nmr实验方案，优化数据采集和处理以提高信噪比。 |
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光学显微技术 （fluorescence microscopy） |
观察蛋白质在细胞内的动态分布和相互作用 | 研究蛋白质相互作用的时空动态、细胞信号传导和调控机制 |
优势：实时观察、非侵入性； 限制：需标记蛋白质、分辨率和深度的限制 |
选择合适的标记方法和探针，优化成像条件和细胞处理步骤， 使用高分辨率成像系统和图像分析软件进行定量和定性分析。 |
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gst pull-down |
利用gst-融合蛋白将目标蛋白质及其结合的互作伙伴富集， 通过亲和纯化和检测来分析相互作用 |
鉴定蛋白质相互作用、筛选结合伙伴、研究蛋白质结构和功能 |
优势：简单易行、高纯度富集、适用于大规模筛选； 限制：需蛋白质的表达和纯化、可能存在非特异性结合和假阳性 |
优化选择合适的gst标签和亲和纯化条件， 进行对照实验和负对照实验， 结合其他技术进行互补验证， 使用高灵敏性检测方法进行验证。 |
三、酵母双杂交技术适用于多个研究领域，包括但不限于以下方面：
● 蛋白质相互作用研究：酵母双杂交技术广泛应用于研究蛋白质之间的相互作用网络。通过识别和验证蛋白质间的相互作用关系，可以揭示蛋白质复合物的组成和结构，从而深入了解细胞信号传导、转录调控、代谢途径等生物过程。
● 蛋白质功能研究：通过酵母双杂交技术，可以研究蛋白质的功能和调控机制。例如，通过识别蛋白质与转录因子、核酸结合蛋白等的相互作用，可以了解蛋白质在基因调控中的作用，以及调控网络的建立和维持。
● 药物研发：酵母双杂交技术可应用于药物研发领域。通过筛选药物分子与靶蛋白之间的相互作用，可以评估药物的潜在效果和副作用，优化药物设计，加速药物发现过程。
● 疾病研究：酵母双杂交技术可用于研究与疾病相关的蛋白质相互作用。通过筛选与疾病相关基因的相互作用蛋白质，可以揭示疾病的发生机制，寻找潜在的治疗靶点。
● 进化生物学研究：酵母双杂交技术可以用于研究物种间的蛋白质相互作用。通过比较不同物种中的相互作用网络，可以了解蛋白质相互作用的进化变化，探究物种适应性和进化的基础。
总而言之，酵母双杂交技术在多个研究领域具有广泛的应用。它为研究蛋白质相互作用、揭示蛋白质功能和调控机制、药物研发和疾病研究等提供了有力的实验工具和方法。
