gst pull down实验怎么做？-凯发k8网页登录

    gst pull-down 实验（谷胱甘肽 - s - 转移酶 pull - down 实验）是一种用于验证蛋白质 - 蛋白质相互作用的体外实验方法。以下是详细的实验步骤：

一、实验材料准备

1、构建表达载体

    首先需要构建两个表达载体。一个是将目标蛋白（猎物蛋白，prey）的基因克隆到合适的表达载体中，如 pgex 系列载体（用于表达 gst 融合蛋白）；另一个是将可能与之相互作用的蛋白（诱饵蛋白，bait）的基因克隆到普通的表达载体中，如 pet 系列载体（用于表达非融合蛋白或带有其他标签的蛋白）。

    这些载体应该能够在合适的宿主细胞（通常是大肠杆菌）中高效表达。例如，pgex 载体带有谷胱甘肽 s - 转移酶（gst）标签，在大肠杆菌中受 iptg 诱导表达。

2、试剂准备

    细菌培养试剂：lb 培养基（含有胰蛋白胨、酵母提取物和 nacl），抗生素（如氨苄青霉素、卡那霉素等，根据载体抗性选择）。

    蛋白纯化试剂：谷胱甘肽 - 琼脂糖珠（glutathione - sepharose beads），用于结合 gst 融合蛋白；裂解缓冲液（如含有 1% triton x - 100、150 mm nacl、50 mm tris - hcl ph 7.5、1 mm edta、1 mm dtt 和蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液），用于裂解细菌细胞和保持蛋白活性；洗脱缓冲液（如含有 10 mm 还原型谷胱甘肽的 50 mm tris - hcl ph 8.0 缓冲液），用于从琼脂糖珠上洗脱 gst 融合蛋白。

    其他试剂：iptg（异丙基 - β - d - 硫代半乳糖苷）用于诱导蛋白表达，考马斯亮蓝染色试剂或 western blotting 试剂用于检测蛋白。

3、仪器准备

    低温离心机：用于细菌细胞的收集和离心。

    摇床：用于细菌培养。

    蛋白电泳设备：包括电泳槽、电源等，用于检测蛋白。

二、蛋白表达与细菌裂解

1、蛋白表达

    将构建好的带有 gst - 猎物蛋白（gst - prey）的表达载体和带有诱饵蛋白（bait）的表达载体分别转化到合适的大肠杆菌菌株（如 bl21）中。
挑取单菌落接种到含有相应抗生素的 lb 培养基中，37℃振荡培养过夜。

    次日，将过夜培养物以 1:100 的比例接种到新鲜的含有抗生素的 lb 培养基中，继续培养至 od₆₀₀达到 0.6 - 0.8。

    加入 iptg（终浓度一般为 0.1 - 1 mm）诱导蛋白表达，在适当温度（如 16 - 30℃）下继续培养数小时（一般 3 - 6 小时），以增加蛋白表达量。

2、细菌裂解

    诱导结束后，离心收集细菌细胞（4℃，5000g，10 分钟）。
用预冷的裂解缓冲液重悬细菌细胞，使细胞浓度达到合适的范围（如 1 - 5×10⁸个细胞 /ml）。

    通过超声破碎或溶菌酶处理等方法裂解细菌细胞。超声破碎时，一般采用工作 3 秒，间歇 7 秒，共超声 3 - 5 次，功率为 200 - 300w，以确保细胞充分裂解，同时避免蛋白变性。

    裂解后的样品在 4℃下离心（12000g，30 分钟），收集上清液，即为含有目的蛋白的裂解液。

三、gst pull - down 实验操作

1、珠子预处理

    取适量的谷胱甘肽 - 琼脂糖珠，用裂解缓冲液洗涤 3 - 5 次，每次洗涤后离心（4℃，500g，5 分钟），去除保存珠子的乙醇等杂质，使珠子处于良好的结合状态。

2、结合反应

    将洗涤后的谷胱甘肽 - 琼脂糖珠加入到含有 gst - prey 蛋白的裂解液中，4℃下缓慢摇动孵育 1 - 2 小时，使 gst - prey 蛋白充分结合到琼脂糖珠上。

    孵育结束后，离心（4℃，500g，5 分钟）收集珠子，用裂解缓冲液洗涤 3 - 5 次，每次洗涤后离心（4℃，500g，5 分钟），以去除未结合的蛋白。

3、与诱饵蛋白孵育

    将洗涤后的带有 gst - prey 蛋白的珠子重悬于适量的裂解缓冲液中，加入含有诱饵蛋白（bait）的裂解液，4℃下缓慢摇动孵育 2 - 4 小时或过夜，使诱饵蛋白和 gst - prey 蛋白有充分的时间相互作用。

4、洗涤与洗脱

    孵育结束后，离心（4℃，500g，5 分钟）收集珠子，用裂解缓冲液洗涤 4 - 6 次，每次洗涤后离心（4℃，500g，5 分钟），以去除非特异性结合的蛋白。

    最后，用洗脱缓冲液洗脱结合在珠子上的蛋白复合物，收集洗脱液。洗脱时可以在室温下孵育 10 - 30 分钟，期间可以轻轻摇动。

四、检测与分析

蛋白检测方法

    考马斯亮蓝染色：将洗脱液和对照（如单独的 gst - prey 蛋白、单独的诱饵蛋白以及未经过孵育的珠子洗脱液等）进行 sds - page（十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳），电泳结束后，用考马斯亮蓝染色液染色 1 - 2 小时，然后用脱色液脱色，观察蛋白条带。如果诱饵蛋白和 gst - prey 蛋白相互作用，在含有两者的样品泳道中应该能看到新的蛋白条带或蛋白条带的迁移位置发生变化。

    western blotting：可以将 sds - page 电泳后的蛋白转移到 pvdf 或硝酸纤维素膜上，然后用针对诱饵蛋白或 gst - prey 蛋白的特异性抗体进行检测。如果两者相互作用，在相应的位置会出现免疫反应阳性条带，这种方法比考马斯亮蓝染色更灵敏，能够检测低丰度的蛋白。

    在进行 gst pull - down 实验时，还需要设置多个对照实验，如单独的 gst - prey 蛋白与珠子的孵育、单独的诱饵蛋白与珠子的孵育等，以排除非特异性结合等假阳性结果，确保实验结果的准确性。