wb免疫学检测|pcr分子生物学检测|ip免疫荧光检测 -凯发k8网页登录

（1）wb（western blot ）蛋白免疫印迹杂交 ： 是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。 （2）ihc /icc（immunohistochemistry/immunocytochemistry ）免疫组织/细胞化学是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、酶、金属离子、同位素） 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究 （3）if （immunofluorescence ）免疫荧光：是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 icc通过酶反应显色，if主要测荧光；用的抗体和识别的表位是一样的，做法几乎一样。只是标记二抗不一样。

多抗是免疫动物后得到的抗血清经纯化得到的抗体，这些抗体分子识别抗原的表位不尽相同。 ①从纯化方式来看：采用proteina/g纯化的多抗掺杂有动物本身产生的对其自身抗原产生的抗体，这些抗体在检测中会识别样本中的蛋白而出现杂带；采用抗原亲和纯化的多抗只包括识别免疫原的抗体分子可以避免杂带的产生； ②从蛋白修饰来看：天然蛋白存在复杂的翻译后修饰。甲基化、乙酰化对分子量变化影响小，而磷酸化、糖基化、泛素化可能会使部分蛋白分子量偏大，当然也存在翻译后修饰后条带变小的情况。 ③从蛋白翻译后加工来看：翻译后蛋白前体经切割可能会使部分蛋白分子量偏小，而天然组织中同时存在蛋白前体和切割加工后的蛋白，二者序列有相同部分，可能会产生杂带。 ④从同源家族蛋白来看：当目的蛋白有同源家族蛋白时，蛋白异构体的存在可能会使分子量偏离预测分子量，因为天然样本中由同一个mrna不同的剪接方式进行翻译形成的蛋白产物也会有相同的抗原表位，同时被抗体识别时会产生杂带。这点可以通过信息学分析进行解释。 ⑤从蛋白聚集形式来看：蛋白多聚体的形成，虽然还原条件可以抑制多聚体的形成，但是强烈的蛋白间相互作用在还原条件下也有可能不解聚导致条带偏大。这点需要通过查阅与目的蛋白相关文献进行了解。 ⑥从抗体特异性来看，如果待测样本中有与目标蛋白同源性较高的组分，在验证时也会出现杂交信号，其次多克隆抗体是通过动物免疫，制备抗血清进而纯化得到多抗的，如果免疫宿主本身含有的抗体跟待测样本有交叉，同样也会出现信号。 简要解释： a、纯化方式，我们目前采用的是proteina/g亲和纯化，纯化的多抗也包含了兔子自身的igg抗体； b、蛋白修饰：天然蛋白存在复杂的翻译后修饰，有的甚至会影响条带的大小； c、蛋白翻译后加工的作用，导致不同剪切体出现，两者之间若有相同部分，也会产生杂带； d、同源家族蛋白的影响； e、蛋白多聚体的影响，虽然还原条件可以抑制多聚体的形成，但也会有不解聚的情况导致条带偏大； f、抗体特异性，多抗是通过动物免疫，制备抗血清纯化而来，如果免疫宿主本身含有的抗体跟待测样本有交叉，也会出现杂交信号。

出现这种情况我们现在的技术水平很难解释，我们猜想可能的原因是： ①突变体混入阳性样本； ②生物体样本发生基因的代偿； ③同源家族蛋白较多，即便目的基因敲除或者移码或者截短，如果抗体识别的表位是同源蛋白共有的或者移码前的或者截短前的，那么验证突变体样本依然会有条带； ④突变体构建不成功 由于这些原因很难验证，所有我们才会有不验证突变体的提议。如果后续客户一定要做，认为这是验证抗体特异性的标准，那么必须提供突变体样本pcr测序结果，同时按照我们的要求发送文档，显示具体的突变位点，我们在接收到样本之后，也会先进行检测，在以上信息均确认的基础上，再拟定合同，启动实验！ ⑤对于植物样本： 植物蛋白之间的相互作用太复杂了，多为多倍体，而且很多在数据库也没信息可查询，至于是否会出现基因代偿等作用，或者敲除某一个基因，但是跟它有类似功能的高同源基因会不会替代或者促进被突变的恢复正常表达等等，应该目前都没办法解释吧，因为我也不是做这块的，细致的蛋白功能研究，我确实不懂，也只是跟其他研究这块的老师有过沟通，所以目前这个hsp82目前我们只能做到这种程度了，即便再做我也没有信心做好，因为刚才提到的那个高同源性基因的问题确实存在。

要想做好磷酸化蛋白的wb检测，样本抽提是很关键的一步，但是却又是最容易出现问题的一步，因为处于不同细胞生长状态或者特定细胞周期时，磷酸化蛋白可能仅占细胞总蛋白的一小部分，而且处理不当时，样品还会快速的去磷酸化；其次蛋白抽提的效率，并不是所有的蛋白都能被抽提到可溶性组分中，而且目前已有不少文献证明，很多蛋白存在于被舍弃的沉淀中，所以如果蛋白抽提过程中目标蛋白被损失了一部分，那么磷酸化和非磷酸化蛋白之间的比例就会发生变化，导致数据偏差；最后还有wb操作过程中的一些条件控制，比如封闭问题，抗体使用比例问题，或者待检测的磷酸化蛋白量低于wb的检测限等等，都有可能造成最终wb实验的检测失败！