表观遗传 | 超级增强子相关lncrna如何影响肝癌-凯发k8网页登录

    前言：增强子(enhancer)，是距离启动子较远距离的一段可与蛋白质（反式作用因子，trans-acting factor）结合的区域，可以被转录因子等蛋白结合从而激活基因转录。增强子在不同类型细胞以及不同发育阶段会有不同活性，并且与转录因子（transcript  factor, tf）等蛋白的结合也具有特异性，因此增强子是调控基因特异性表达重要的顺式作用元件（cis-regulatory element）（fig 1）[1]。

 

figure 1 转录因子调控增强子活性示意图[1]。（a）在不同时空中，特定tf通过转录或细胞外信号进行识别motif序列与增强子结合并激活增强子。（b）顺式调控元件含有特定的tf基序（motif）。tf招募共激活因子或共阻遏因子，其调控增强子的活性。

    在后生动物中，启动子具有h3k4me3标记，同样增强子在基因组上也有特殊的身份标记——增强子特征是具有染色质开放性和组蛋白h3k4me1修饰，活性增强子（active enhancer）具有h3k27ac标记，静态/起始增强子（poised/primed enhancer）缺少h3k27ac标记（fig 2）[2]。因此我们可以根据cut&tag、chip-seq和atac-seq等技术鉴定增强子位点。

figure 2 顺式调控元件基因组特征[2]。增强子特征是具有染色质开放性和组蛋白h3k4me1修饰，活性增强子（active enhancer）具有h3k27ac标记，静态/起始增强子（poised/primed enhancer）缺少h3k27ac标记。

    随着对增强子在转录调控作用研究的深入，richard a. young团队于2013年提出超级增强子概念——超级增强子(super-enhancer, se)比普通增强子(typical enhancer，te)具有更高的转录激活相关组蛋白修饰（h3k27ac、h3kme1等）、mediator复合体和brd4蛋白(bromodomain containing 4)及转录因子的富集密度，超级增强子区域长度通常可达8-20 kb，远高于普通增强子的200-300 bp长度[3]。长非编码rna（lncrna）的异常表达已在多种癌症中屡见报道，而se与lncrna关联的新研究思路近年来初露锋芒。se-lncrna就是超级增强子关联的lncrna，它紧靠se并且其转录活性受到se的调控。这里小编分享2篇近期的肝癌方面se-lncrna高水平研究，帮助各位老师了解se-lncrna课题研究思路。

 

一、超级增强子驱动的lncrna-daw通过激活wnt/b-catenin途径促进肝癌细胞增殖
 

    广州中医药大学张锦芳团队2021年在mol ther nucleic acids. 发表super-enhancer-driven lncrna-daw promotes liver cancer cell proliferation through activation of wnt/β-catenin pathway一文揭示了lncrna-daw在肝癌发展中的作用机制[4]。

    1、首先比较各人体组织中h3k27ac chip-seq数据，以筛选肝部特异性se（fig 3）。与其他实体瘤相似，在肝细胞癌（hcc）中也经常检测到基因组dna拷贝数的扩增，包括20q13.12的扩增，既往研究表明，20q13.12片段的获得与肝癌患者的肝转移、总生存期及不良预后显著相关。而20q13.12片段在hcc中有比正常细胞更高的h3k4me1和h3k27ac信号，该位点可能含有肝脏特异性超级增强子。

 figure 3 人各组织h3k27ac数据[4]。（a） 一组正常人体组织中lncrna daw（linc01430）基因座的h3k27ac-chip-seq数据。黄色区域表示lncrna daw的位点。（b） 肝细胞中lncrna daw基因座的超级增强子组蛋白标记的chip-seq数据。

    2、在该se区域鉴定到8个此前未报道的lncrna，根据rna-seq数据，此前被称为lncrna-daw的lncrna在肝组织中高表达。比较肝细胞癌（hcc）和正常细胞中表达量，发现lncrna-daw显著上调。因此，作者将它确定后hcc候选靶点lncrna进行进一步细胞和动物实验。

    3、超级增强子经常被各种转录因子占据以发挥作用，作者筛选lncrna-daw所在se依据ucsc基因组浏览器和cistrome数据库候选结合的tf，发现该基因位点与肝细胞核因子家族成员hnf4g结合。根据chip-seq实验、双荧光素酶实验和rt-pcr实验，hnf4g 与候选区域中的se-1 和 se2结合，并且hnf4g促进lncrna-daw表达。

    4、作者通过体外过表达和裸鼠实验证明lncrna-daw促进癌细胞增殖和转移。对lncrna-daw过表达细胞进行rna-seq，对癌症相关通路中选择候选基因进行rt-qpcr实验和sirna干扰实验，wnt2基因表现受到lncrna-daw调控。

    5、根据此前报道lncrna可能与多梳蛋白抑制复合物（polycomb repressive complexes， prc）结合，作者发现prc核心成分ezh2会抑制wnt2表达。根据chip-seq实验发现，ezh2会结合wnt2启动子从而抑制转录。

    6、作者通过rip-qpcr验证ezh2会结合lncrna-daw，lncrna-daw过表达后ezh2对wnt2启动子抑制效果下降。由于过去报道多种lncrna可以调节rna结合蛋白的磷酸化和稳定性，于是作者通过wb验证了lncrna-daw的瞬时过表达以剂量依赖性方式降低内源性ezh2蛋白量。

    7、依据细胞和动物实验作者证明wnt2激活了wnt/β-catenin通路促进癌细胞增殖。作者根据50对肝癌表达谱数据发现hcc标本中lncrna-daw和wnt2的表达之间的显著正相关，lncrna-daw和wnt2表达的增加可能是人类hcc组织中的常见事件，表明lncrna-daw和wnt2可能作为肝癌患者的假定治疗靶点（fig 4）。

 figure 4 lncrna-daw调控wnt2促进肝癌细胞增殖示意图[4]。

 

二、lncrna fasrl促进脂肪酸生物合成并加剧肝癌进展
 

    中山大学彭丽团队于去年在advanced science上发表了题为“upregulation of superenhancer-driven lncrna fasrl by usf1 promotes de novo fatty acid biosynthesis to exacerbate hepatocellular carcinoma”文章。研究发现了一种名为fasrl 的lncrna表达受超级增强子调控，表达上调后可以促进脂肪酸的从头合成，从而促进肝细胞癌的发生[5]。

    1、作者通过hepg2、huh7、plc、lm3（四种肝癌细胞系）和正常肝组织的h3k27ac数据，筛选并鉴定了由hcc细胞中异常超级增强子调节的lncrna（fig 5）。作者鉴定到31个肝癌特异性se相关的lncrna，其中3个lncrna在hcc样本中上调，其高表达与hcc患者预后较差相关。作者将其中表达差异最大的1个lncrna命名为 “fasrl”并作为候选肝癌靶点se-lncrna。fasrl位于16号染色体上，长度为15551 bp，包含两个外显子和一个内含子。

figure 5 筛选肝癌特异性超级增强子[5]。a-e. 正常肝组织和四种肝癌细胞系超级增强子，fasrl是四种癌细胞系共有的特异性超级增强子，虚线代表rose软件判断se的阈值。g. fasrl处h3k27ac信号，虚线为增强子位点，四种肝癌细胞中存在较高h3k27ac信号，而正常肝细胞中不存在。

    2、作者将fasrl的五个增强子序列进行双荧光素酶实验，增强子e4对fasrl表达增强效果最强。为了探究se调控fasrl表达上游机制，作者对fasrl序列进行转录因子motif分析，把将排名前十的tf表达量与fasrl表达量进行相关性分析，相关性最高的是热休克转录因子1（hsf1）。之后通过sirna和chip-qpcr实验证明tf usf1可以通过与hcc中的se结合来转录驱动fasrl表达（fig 6）。

figure 6 验证hsf1是调控fasrl的转录因子[5]。a. fasrl区域序列前10可能结合的tf motif序列。b. 10个tf和fasrl表达相关性。c,d. sirna干扰usf1后hepg2和lm3细胞系中usf1和fasrl表达量和蛋白含量。e,f. 双荧光素酶实验显示了shrna敲低usf1后e4的转录活性下降。g. 在e4序列上设计了4对chip-qpcr引物，h图为usf1结合se的chip-qpcr结果。

    3、作者进行体外实验验证fasrl是否能够影响肝癌细胞进展。通过sirna敲低fasrl后细胞增殖、细胞迁移、细胞凋亡证明fasrl可以促进hcc细胞的致癌生长。之后将稳定转染shfasrl或shnc的hcc细胞系皮下注射到裸鼠中，观测到shfasrl显著减缓了裸鼠中肿瘤细胞的增殖。

    4、为了揭示fasrl的特定下游调控途径，作者依据sifasrl转录组数据进行基因集富集分析（gsea），fasrl敲低与脂肪酸（fa）途径相关基因的表达呈显著负相关，之后进行rt-qpcr和wb实验验证了这个发现（fig 7）。

 figure 7 fasrl参与hcc脂肪酸代谢通路[5]。a,b 敲除fasrl表达后表达改变的基因在脂肪酸（fa）代谢通路中富集。c,d qrt-pcr显示fasrl表达下调后，fa代谢通路中表达显著改变的基因表达量热图。e,f fasrl的表达下调后，fa代谢通路中基因的mrna表达显著下调。g. wb显示fasrl 表达在 hepg2 和 lm3 细胞系中敲低后 fa 代谢途径中基因的蛋白质含量改变。

    5、为了进一步探索与fasrl直接相互作用的蛋白质，作者使用rna pull down-ms鉴定与fasrl直接相互作用的rna结合蛋白，ms结果显示乙酰辅酶a羧化酶1（acaca）直接与fasrl结合，之后进行rip-qpcr、fish、ihc和wb进行进一步验证。先前的研究表明，acaca （ser79） 的磷酸化抑制其酶活性并减少 fa 合成，而本研究发现敲低fasrl表达增加了磷酸化acaca的水平，fasrl与acaca结合并抑制其磷酸化，从而增加了fa的合成。

    6、acaca是脂质代谢中的重要酶，是控制从头fa生物合成的中心酶。作者用同位素13c6-标记葡萄糖追踪fa合成，证明敲低fasrl抑制了从头fa合成，另外fasrl敲低显著降低了甘油三酯（tg）含量。之后通过油红o染色实验和对脂滴荧光标记进一步验证了在敲低fasrl表达后hcc细胞中的脂滴数量显著减少。

    7、综上所述，这项工作发现usf1可以通过se驱动fasrl表达，fasrl和acaca之间的相互作用增加fa合成，以促进肿瘤进展（fig 8）。作者期望未来开发抑制tf usf1或se的药物来降低fasrl的表达或抑制fasrl与acaca的结合以减少fa合成，最终达到抑制hcc的目的。

 

figure 8 se-lncrna fasrl影响肝癌进展机制[5]。

    总结以上两篇文章中涉及实验有chip-seq、chip-qpcr、rna-seq、rip-qpcr、rna pull down-ms、双荧光素酶报告基因、coip-ms、细胞功能实验、动物建模实验等。对于这些实验，武汉金开瑞生物均有大量项目经验，可助力您课题研究，欢迎各位老师咨询！

参考文献：

[1] zeitlinger j. seven myths of how transcription factors read the cis-regulatory code. curr opin syst biol. 2020;23:22-31. doi:10.1016/j.coisb.2020.08.002

[2] preissl s, gaulton kj, ren b. characterizing cis-regulatory elements using single-cell epigenomics. nat rev genet. 2023;24(1):21-43. doi:10.1038/s41576-022-00509-1

[3] whyte wa, orlando da, hnisz d, et al. master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. cell. 2013;153(2):307-319. doi:10.1016/j.cell.2013.03.035

[4] liang w, shi c, hong w, et al. super-enhancer-driven lncrna-daw promotes liver cancer cell proliferation through activation of wnt/β-catenin pathway. mol ther nucleic acids. 2021;26:1351-1363. published 2021 nov 3. doi:10.1016/j.omtn.2021.10.028

[5] peng jy, cai dk, zeng rl, et al. upregulation of superenhancer-driven lncrna fasrl by usf1 promotes de novo fatty acid biosynthesis to exacerbate hepatocellular carcinoma [published online ahead of print, 2022 oct 28]. adv sci (weinh). 2022;10(1):e2204711. doi:10.1002/advs.202204711