分子互作 | 蛋白-凯发k8网页登录
一、gst pull down 实验简介
gst pull down是常用的蛋白与蛋白互作实验方法,利用带有标签的已知蛋白作为诱饵蛋白(最常用的是gst标签,即谷胱甘肽巯基转移酶,glutathione s-transferase),诱饵蛋白特异性结合谷胱甘肽亲和树脂,当目的蛋白溶液过柱时,将诱饵蛋白及其相互作用的蛋白复合物捕获。复合物洗脱后,通过蛋白凝胶电泳分析两种蛋白间的相互作用,或者筛选相应的目的蛋白。
二、应用背景
通过蛋白-蛋白互作的研究技术gst pull down这个实验,研究人员能够探究蛋白质之间的相互作用,揭示细胞内复杂的信号传递和调控网络。这不仅有助于我们对疾病发生机制的理解,还为药物研发和治疗策略的开发提供了重要的参考。
三、gst pull down原理简介
四、pull down实验流程
(1)蛋白提取与蛋白浓度测定;
(2)pull down前wb检测诱饵蛋白及猎物蛋白的表达;
(3)pull down实验,包括以下步骤:
a.磁珠准备,将磁珠分装且标记为实验组和对照组,用预冷的ip洗涤液重悬磁珠;
b.磁珠结合诱饵蛋白gst-a(实验组加诱饵蛋白gst-a,对照组加标签gst蛋白),静音混合2h后用预冷的ip洗涤液进行洗涤重悬磁珠;
c.诱饵蛋白结合互作蛋白his-b(实验组合对照组分别加入his-b或总蛋白),4℃静音混合过夜(约16h)后用预冷的ip洗涤液进行洗涤重悬磁珠;
d.洗脱;
(4)pull down后wb检测或者ms检测。
五、样品类型
2、已知蛋白筛选互作蛋白
①重组表达蛋白,带gst或his标签(重组蛋白≥200ug,蛋白浓度0.1mg/ml以上,纯度≥85%,上清表达为宜,包涵体表达需做挂柱测试)
②总蛋白(提供细胞沉淀或新鲜动植物组织)
六、应用延伸
gst pull-down实验的诱饵蛋白除了可以带gst标签外,还可以带his标签,则称his pull-down实验,也有使用多肽或者化合物进行pull down实验,称为多肽pull-down或者化合物pull-down实验。
七、实验常见问题
1、ip、co-ip、pull-down的区别?
通常ip或coip使用组织细胞材料,靶蛋白为内源天然蛋白或组织细胞中过表达蛋白(可融合标签)。pull-down中的诱饵蛋白一般经重组表达获得。ip和coip需要使用亲和力好的一抗,选购时需注意相应验证数据。
简单来说,ip捕获目的蛋白,co-ip捕获目的蛋白和其互作蛋白,pull-down用融合标签的重组蛋白来捕获其互作蛋白。
2、如何区分蛋白表达在上清还是包涵体?
蛋白有可能表达在上清也可能表达在包涵体中,超声碎菌之后,如果菌液比较清亮,沉淀比较少,那表达的蛋白基本是可溶的;如果超声之后,菌液是浑浊的,而且在离心后沉淀比较多,且沉淀的颜色也比较白,蛋白基本就是在表达在包涵体中了。
3、如果蛋白表达在包涵体中是否可以进行后续gst pull down实验?
包涵体,就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的,用高浓度的尿素和盐酸胍可以使其变性,解聚后再尝试。
八、案例分享
mitophagy associated self-degradation of phosphorylated map4 guarantees the migration and proliferation responses of keratinocytes to hypoxia
期刊:cell death discovery
if:7.109
发表时间:2023/5/17(文章中材料和方法提到金开瑞)
c the direct interaction of gst-lc3 and his-map4-1 (1–170 aa) measured by gst pull-down. n = 3. d the direct interaction of gst-lc3 and hismap4-2 (398–547 aa) detected by gst pull-down. n = 3. e, f the direct interaction of gst-lc3 with map4-1 mut1△34,37 or map4-1 mut2△47,50
detected by gst pull-down. n = 3.
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