分子互作 | rna-凯发k8网页登录

信息来源:金开瑞 作者:genecreate 发布时间:2023-07-18 10:17:18

  rna pull down-实验简介  

    rna pull down是检测rna结合蛋白与其靶rna之间相互作用的主要实验方法之一。使⽤体外转录法标记⽣物素rna探针,然后与胞浆蛋⽩提取液孵育,形成rna-蛋⽩质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合,从⽽与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后,通过wb实验检测特定的rna 结合蛋⽩是否与rna 相互作⽤。若待检测⽬的蛋⽩明确,选择wb鉴定;若不明确,则可选择质谱鉴定。
 

 

  应用背景  

 

    蛋⽩质与rna的相互作⽤是许多细胞功能的核⼼,rbps在转录后水平参与调控mrna稳定性、lncrna活性、应激、肿瘤发生发展、细胞凋亡等众多生物学过程,且与诸多人类疾病密切相关。因此,对rbps-rnas相互作用的研究和鉴定有重要意义。
 

  原理简介  

 

rna蛋白互作
 

  实验流程  

 

(1)目标rna的制备及生物素标记

    目标rna制备的一般流程包括:

    构建rna过表达质粒:基因合成 测序验证

    体外转录模板准备:设计含t7启动子引物;pcr扩增得到转录模板

    体外转录:以pcr产物为模板,体外转录得到目的rna

(2)磁珠富集rna

(3)rna结合蛋白孵育

(4)rna结合蛋白洗脱,银染质检:sds-page电泳银染检测富集蛋白的情况

(5)wb或者ms检测

(6)鉴定猎物:rna用qpcr鉴定;已知蛋白用wb鉴定;未知蛋白用质谱鉴定
 

 

  样品类型  

 

    细胞或组织为主

        a)rna 序列信息或对应 id

        b)细胞:3×10^7(细胞沉淀不少于 80μl)

        c)动物组织:0.2g

    获取难易程度:细胞系扩大培养即可(推荐用细胞系,如果没有细胞系,则考虑组织样品);其他样品获取难度根据实际情况去考虑即可;

    样品量:样品量直接影响提取蛋白的含量,最终影响富集蛋白量;

    其他物质的干扰等影响因素:在没有细胞系的情况下,选择组织样品。动物组织中脂肪等物质存在影响。
 

 

  应用延伸  

    rna pull-down除了可以研究rna与蛋白互作,也可以研究rna与rna互作,可通过探针法来研究。

 

体外转录法

探针法

原理

将诱饵rna标记为探针,直接将猎物吸附于磁珠上

针对难以转录的诱饵rna,利用探针结合诱饵rna,间接的把猎物吸附于磁珠上

对照

antisense

无意义序列探针

应用范围

诱饵rna长度在300-1500bp

诱饵rna太短或太长

优点

特异性强。体外转录得到的是纯的诱饵rna片段,不存在其它rna的非特异性干扰,也不存在同源性的问题,所以特异性强,结果可靠性高。

不需要体外转录步骤,所以相对来说更简单,可以适用于几乎所有的rna。

缺点

需要扩增得到体外转录rna模版,同时要体外转录得到目的rna,而dna扩增和rna逆转录都是需要比较合适的条件合适的引物才行,太长或结构问题的会导致扩增或转录不出来,相对探针法更困难。

由于很多rna在细胞里面存在序列接近甚至完全包含诱饵rna的转录本,所以当碰到这种情况时没法设计探针,另外由于是间接性的钓取猎物,多了探针作为过渡,效率不一定有体外转录直接得到目的rna做探针的效率高。

 

 

实验常见问题

rna结合蛋白的亲和力不够的原因?

    可能的原因:

        1)结合缓冲环境没有优化;

        2)裂解不完全;

        3)磁珠用量不足;

        4)rna探针用量不足。

    凯发k8网页登录的解决方案:

        1)优化孵育时间、温度、盐浓度等条件;

        2)增加裂解液和蛋白上样量的比例;

        3)增加磁珠或探针用量;

        4)确定生物素和链霉亲和素效率。

 

rna结合蛋白没有结合的原因?

    可能的原因:

        1)靶蛋白量不足;

        2)缓冲体系不对;

        3)rna探针和蛋白的亲和力本来就低。

    凯发k8网页登录的解决方案:

        1)增加上样蛋白量;

        2)应用低盐体系;

        3)加入交联试剂。

 

wb信噪比高的原因?

    可能的原因:

        1)阳性信号率低;

        2)一抗效率低;

       3)蛋白没有充分沽解。

    凯发k8网页登录的解决方案:

        1)增加一抗的量;

        2)用敏感度的化学发光液;

        3)用细胞裂解液预孵一抗;

        4)增加样品的量;

        5)确定有没有其他可能的结合情况;

        6)增加裂解液用量。

 

结合的非特异性高的原因?

    可能的原因:

        1)缓冲环境没有优化;

        2)缓冲环境严谨性低;

        3)样品没有裂解完全和裂解体系没有优化。

    解决的方案:

        1)优化孵育时间、温度、盐浓度等条件;

        2)使用严谨性高的缓冲体系;

        3)调低rna探针和样品的比例;

        4)提高裂解液的量。

 

做rna pull down 质谱一般会发现多个互作蛋白,对多个蛋白,如何选择就哪一种继续研究下去?

    不同的rna结合蛋白数量不等,根据实际鉴定的蛋白进行筛选;筛选的原则是根据自己研究的方向或相关功能确定这类蛋白。
 

 

  案例分享  

 

circular rna circesyt2 regulates vascular smooth muscle cell remodeling via splicing regulation

期刊:j clin invest  if:11.864  发表时间:2021

rna pulldown




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