技术专题
长链非编码rna linc00473通过分泌microrna-195-5p上调pd-l1促进胰腺癌进展
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2019-07-26 09:00
题目：long noncoding rna linc00473 drives the progression of pancreatic cancer via upregulating programmed death-ligand 1 by sponging microrna-195-5p.
期刊：j cell physiol（if= 4.522）
主要技术：双荧光素酶实验、ago2-rip、rna pulldown
研究背景
胰腺癌（pancreatic cancer ，pc）被认为是致命的恶性肿瘤，伴随着高死亡率和不良预后，其在全世界日益成为严重的健康负担。虽然手术，化疗和放射治疗可以轻度缓解pc患者的症状，但由于缺乏有效的诊断标志物在初始阶段监测pc及预测预后，pc仍然面临不令人满意的临床结果。因此，迫切需要寻找其他可能的pc治疗方法。最近，程序性死亡配体1（pd-l1），已被用于肿瘤治疗，作为多种肿瘤的治疗靶点，尤其是pc。pd-l1充当t细胞活化的负调节分子，通过与pd-1的互做，改变免疫监视状态从而介导肿瘤进展。在临床结果不佳的pc患者中报告了pd-l1的过度表达。已经证明几种非编码rna可以下调pd-l1，从而提高靶向治疗的治疗效果。因此，该研究旨在研究lncrna、mirna在pc进展中潜在的分子机制。
研究内容及结果
1.linc00473 与pd-l1在pc中上调，mir-195-5p在pc中下调，并且pd-l1的高表达与预后不良有关
作者首先检测了134例pc组织及20例正常胰腺组织，通过ihc发现pd-l1主要表达在细胞膜上，pc组织中pd-l1阳性率（57.69％）显著高于正常胰腺组织（23.53％，p <0.05；图1）。此外，临床病理资料分析显示，pd-l1阳性表达与肿瘤分期、肿瘤大小、lnm和远处转移密切相关（p <0.05），而与与年龄、性别、神经周围侵犯及肿瘤分化无关。随后，对85例pd-l1阳性及49例pd-l1阴性患者进行kaplan-meier生存分析，发现pd-l1阳性的pc患者的总体存活期比pd-l1阴性的患者短（p <0.05；图2），提示高表达的pd-l1与不良预后相关。
随后，对于pc组织及正常组织中的linc00473、pd-l1及mir-195-5p表达进行了检测，发现相较于正常组织，linc00473、pd-l1表达上调，而mir-195-5p表达下调（图3a、b、c）。此外，作者还在正常胰腺细胞系h6c7及pc细胞系sw-1990、panc-1、bxpc-3、aspc-1及capan-2检测了linc00473的表达，发现相较于h6c7，linc0047在所有pc细胞系中均表达较高，且在sw-1990中表达最高（图3d），因此后续也选用sw-1990细胞系开展机制研究。
图1 pd-l1在pc组织中高表达
图2 pd-l1高表达与pc患者总体生存率低下相关
图3 linc00473 与pd-l1在pc中上调，mir-195-5p在pc中下调
2. mir-195-5p可以靶向调控pd-l1的表达，过表达mir-195-5p可以通过下调pd-l1表达抑制pc进展
通过生物信息学预测可以发现，mir-195-5p和pd-l1存在可能的互作位点（图4a）。随后通过双荧光素酶实验发现野生型的pd-l1序列组通过mimics过表达mir-195-5p后荧光强度下降；而将预测到的mir-195-5p和pd-l1结合位点突变之后荧光强度恢复到对照组水平，说明mir-195-5p和pd-l1的确可能通过该位点发生互作（图4b）。加入mir-195-5p mimics后可以发现pd-l1的mrna及蛋白水平均出现了下降，和加入pd-l1的抑制剂atezolizumab后的情况类似（图4c、d、e）。上述实验说明mir-195-5p可以靶向下调pd-l1的表达。
接着，分别采用edu染色、tunel染色、细胞划痕和transwell实验检测了mir-195-5p对sw-1990肿瘤生物学指标的影响，发现mir-195-5p过表达可以抑制细胞增殖（图5a、b），增加细胞凋亡（图5c、d），降低细胞迁移和侵袭能力（图5e、f、g、h）。同时，mir-195-5p过表达还可以调控凋亡相关蛋白bcl-2、bax，细胞迁移侵袭相关蛋白mmp2、mmp9（图5i、j、k）。对上述因子的调控均和pd-l1抑制剂atezolizumab的效果一致，说明mir-95-5p可能通过下调pd-l1表达抑制pc进展。
图4 mir-95-5p靶向下调pd-l1的表达
图5 mir-95-5p可以通过下调pd-l1表达抑制pc进展
3.linc00437可以mir-159-5p的cerna形式上调pd-l1表达，而当linc00437表达下调时pc进展亦受抑制
原位荧光杂交显示linc00437主要定位在细胞质（图6），提示其作为cerna的可能。随后采用生物信息学预测，发现了linc00437与mir-159-5p潜在的结合位点（图7a）。在采用双荧光素酶实验证实linc00437和mir-159-5p的确可能在上述位点发生互作后，作者接下来分别采用ago2-rip与rna pulldown确定了linc00437和mir-159-5p的互作关系。当干扰linc00437表达后，mir-159-5p表达显著上升，pd-l1表达显著下降；而当同时干扰linc00437与mir-159-5p后，pd-l1的表达恢复到对照组水平。pd-l1蛋白的表达也存在同样趋势。上述实验说明linc00437可以结合并调控mir-159-5p，并通过其调控pd-l1的表达。
继续分别采用edu染色、tunel染色、细胞划痕和transwell实验检测linc00437对sw-1990细胞肿瘤生物学指标的影响，发现干扰linc00437过表达可以抑制细胞增殖（图8a、b），增加细胞凋亡（图8c、d），降低细胞迁移和侵袭能力（图8e、f、g、h）。同时，linc00437低表达还可以调控凋亡相关蛋白bcl-2、bax，细胞迁移侵袭相关蛋白mmp2、mmp9（图8i、j、k）。同时，挽救实验也证实同时干扰linc00437与mir-159-5p表达后细胞肿瘤生物学指标得到回复，说明linc00437对细胞肿瘤进程的影响是通过mir-159-5p介导的。
图6 linc00437主要定位在细胞质
图7 linc00437可以cerna形式通过mir-159-5p调控pd-l1的表达
图8 linc00437低表达可以抑制pc进展
4.linc00473可通过吸附mir-195-5p调控pd-l1表达，从而影响cd8 细胞活化
在sw-1990细胞中干扰linc00473及mir-195-5p后，将这些细胞与cd8 细胞共孵育，随后采用elisa检测了细胞培养上清中细胞因子的含量，发现干扰linc00473表达组可导致促瘤细胞因子il-10浓度下降，抑瘤细胞因子ifn-γ与il-4浓度上升；而同时干扰linc00473与mir-195-5p组上述细胞因子浓度均回归到对照组水平（图9a）。继续检测共培养处理后的cd8 细胞发现，干扰linc00473表达组cd8 细胞凋亡减少，pd-1及pd-l1表达减少；同时干扰linc00473与mir-195-5p组cd8 细胞凋亡水平及pd-1、pd-l1表达水平与对照组相当；过表达linc00473组cd8 细胞凋亡水平上升，pd-1及pd-l1表达增加（图9）。
图9 linc00473过表达影响cd8 细胞活化
文章小结
在pc细胞中，linc00473作为结合mir-195-5p的cerna发挥功能，上调pd-l1及其受体pd-1，从而抑制cd8 t细胞活化并促进pc的进展；linc00473沉默或过表达mir-195-5p过下调pd-l1及其受体pd-1抑制细胞增殖，迁移和侵袭，促进pc的细胞凋亡，从而防止pc的发生。
