技术专题
去甲基泽兰醛通过调节mir-30e-5p/mybl2轴抑制胶质瘤的生长
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2019-06-20 09:33
题目：demethylzeylasteral inhibits glioma growth by regulating the mir-30e-5p/mybl2 axis
期刊：cell death and disease（if= 5.638）
主要技术：载体构建+双荧光素酶实验
研究背景
胶质瘤是最常见、最致命、低生存率的原发性脑肿瘤，其特征是高增殖、广泛侵袭和神经系统破坏，且手术放疗后预后相对较差，因此目前仍然急需更有效的治疗策略。雷公藤属于卫矛科植物，从中提取的去甲基泽兰醛（t-96）是一种较低毒性的三萜类化合物，具有免疫抑制、抗炎和抗血管生成作用。在本篇文献中，重点探究t-96在胶质瘤中的抗肿瘤活性，并初步确定t-96抑制肿瘤生长的作用机制，为胶质瘤的临床治疗提供一个新的方向。
研究内容及结果
1.t-96抑制人胶质瘤细胞的生长和增殖
作者首先采用ln-229、u-87、a-172、u-251和u-118细胞株来研究不同浓度的t-96下胶质瘤生长的影响，发现受试细胞的增殖均以剂量依赖性的方式显著降低，且t-96对人脑胶质瘤细胞具有广谱的抗肿瘤作用（图1a）。通过mtt测定细胞活力、brdu 染色分析细胞百分比、软琼脂法观察菌落情况，统计后得到t-96显著地抑制人胶质瘤细胞的生长和增殖（图1b-1c）。
接下来，通过流式细胞仪初步检测t-96对细胞周期的影响，发现t-96治疗以剂量依赖的方式导致细胞在g1/s期显著积累，从而抑制细胞生长和增殖（图2a-2b）。再通过wb分析细胞周期相关蛋白（cdk 4、cdk6和cyclin d1）和分化标志物（gfap 和 β3-tubulin）的表达水平，并结合显微镜观察和流式细胞术来测定凋亡率（图2c-2d），综合得到t-96通过诱导细胞周期停止而不是凋亡来抑制胶质瘤细胞生长。
图1 t-96抑制人胶质瘤细胞的生长和增殖
图2 t-96导致人胶质瘤细胞g1/s细胞周期停滞
2. t-96抑制人胶质瘤细胞的迁移和侵袭
通过跨孔迁移和侵袭实验，来初步评价t-96对人胶质瘤细胞（ln229、u-87和a-172）迁移和侵袭能力的影响，统计得到t-96处理后细胞迁移受到抑制且穿透的侵袭细胞数量显著减少（图3a-3d）。再结合wb测定e-钙粘蛋白和波形蛋白的表达水平，得到t-96能强烈抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力、并逆转了恶性胶质瘤细胞的上皮-间充质转化（图3e）。
图3 t-96抑制人胶质瘤细胞的迁移和侵袭
3.t-96抑制与dna复制和细胞周期进展相关的基因表达
为了进一步探究t-96抑制肿瘤细胞生长和增殖的机制，作者对t96和dmso处理的胶质瘤细胞（（ln229和u-87）进行转录组分析。其中基因本体（go）分析和kfgg分析显示，与dna复制和细胞周期进展相关的基因都是高丰度的且呈现下调的趋势（图4a-4b）；结合qrt-pcr和wb验证差异基因的表达，得到与转录组一致的结果（图4c-4d），t-96能显著地抑制与dna复制和细胞周期进展相关基因的表达水平。
图4 t-96抑制与dna复制和细胞周期进展相关的基因表达
4.mybl2过表达可挽救t-96诱导胶质瘤细胞生长和周期停滞的抑制
前期已检测到mybl2在不同胶质瘤细胞系中广泛表达，而通过qrt-pcr和wb验证得到mybl2的表达以剂量依赖和时间依赖的方式显著下调（图5a），说明mybl2可能是t-96抑制胶质瘤细胞生长和增殖的关键因素。紧接着，开展拯救实验来验证假设，先通过慢病毒感染ln-229和a172细胞来构建mybl2/egfp过表达系，采用mtt分析一周内的细胞生长曲线（图5b-5c），并结合brdu染色分析细胞增殖情况（图5d-5e），得出mybl2过表达可挽救t-96诱导胶质瘤细胞生长的抑制。与此同时，通过流式细胞术分析mybl2/egfp过表达系的细胞周期、wb分析细胞周期蛋白（d1、cdks、orc6、cdc6、cdt1、mcms和 cdc45）的表达水平（图5f-5h），得到mybl2过表达可挽救t-96诱导胶质瘤细胞周期停滞的抑制。
图5 mybl2是t-96抑制胶质瘤细胞生长和增殖的关键因素
5.t-96通过调节mir-30e-5p/mybl2来抑制细胞增殖
鉴于在mybl2/egfp过表达系中，t-96治疗后外源性mybl2蛋白没有显著地降低，由此推测t-96可能在转录水平上抑制mybl2的表达，继而开展机制探究实验。首先通过对mybl2的3’utr靶向mirnas的分析和检测，筛选出显著上调的靶基因mir-30e-5p（图6a）；其次应用mir-30e-5p拮抗物（antago）进行细胞实验，结合qrt-pcr检测分析mir-30e-5p的表达水平（图6b）、mtt法研究单独或联合处理的细胞增殖情况（图6c）、wb验证antago组中细胞周期相关蛋白（cdk 4、cdk6和cyclin d1，图6d-6f）的表达水平，得到t-96通过调节mir-30e-5p/mybl2来抑制细胞增殖，且其中mir-30e-5p表达上调和mybl2表达下调。
图6 t-96通过调节mir-30e-5p/mybl2来抑制细胞增殖
6.t-96抑制体内胶质瘤的生长
最后开展体内验证实验，将ln-229细胞皮下移植到裸鼠体内，来探究t-96在体内对胶质瘤生长的影响。统计生理数据得到，相比较于对照组，t-96治疗后小鼠的肿瘤体积和重量显著地降低（图7a-7b）；结合免疫组化法检测ki67的表达水平、qrt-pcr检测mir-30e-5p的表达水平、wb检测分析mybl2和细胞周期相关蛋白的表达水平，得到t-96还可能通过阻断肿瘤异种移植小鼠的正常细胞周期进程来抑制胶质瘤细胞的生长（图7c-7f）。与此同时，再进行原位植入实验，来研究t-96在体内的抗肿瘤活性，发现可通过血脑屏障达到预期的靶点（图7g-7h）；从整体层面上，完善了t-96抑制人脑胶质瘤细胞增殖和肿瘤进展的机制图（图7j）。
图7 在体内评价了t-96的抗肿瘤作用
文章小结
本研究旨在探究t-96对胶质瘤的抗肿瘤活性，并首次揭示了t-96通过影响dna复制来抑制胶质瘤生长、通过下调mybl2导致g1/s细胞周期停滞的作用机制。一方面，t-96治疗后胶质瘤细胞的侵袭和迁移被显著地抑制，与dna复制和细胞周期相关基因均显著下调不同的是mir-30e-5p显著地上调，结合mybl2过表达系拯救实验和mir-30e-5p拮抗剂验证实验表明两者的参与机制；另一方面，在小鼠模型中，得出t-96通过阻断肿瘤异种移植小鼠的正常细胞周期进程来抑制胶质瘤细胞的生长。综上所述，t-96在体内和体外均可通过调节mir-30e-5p/mybl2轴来抑制胶质瘤细胞的生长，并首次提出了t-96是一种有希望治疗恶性胶质瘤的候选药物。
解析文献
zhang k, fu g, pan gz, et al. demethylzeylasteral inhibits glioma growth by regulating the mir-30e-5p/mybl2 axis. cell death dis. 2018 june 9. doi: 10.1038/s41419-018-108