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【客户文献分享】linc01207和mir-143-5p的竞争机制促进胰腺癌细胞的自噬和凋亡
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2019-05-30 16:21
题目：long non-coding rna linc01207 silencing suppresses agr2 expression to facilitate autophagy and apoptosis of pancreatic cancer cells by sponging mir-143-5p
期刊：molecular and cellular endocrinology（if=3.56）
合作技术： rna pull down+rip
研究背景
胰腺癌是一种严重的恶性肿瘤，伴随着显著地结缔组织增生和间质反应，且5年内相对生存率很低。尽管已发现炎症过程是胰腺癌发展的关键调节器，但由于缺乏筛查的成像方式和特定标志物，导致早期胰腺癌较难被诊断；通常而言，手术是可切除胰腺癌中期最快速的治疗方法，但患者由于药性、转移率高、预后不良和癌症复发等因素，导致继续面临着不利结果。在本篇文献中，重点探究长链非编码rna（linc01207）在胰腺癌细胞自噬和凋亡中的作用，及其与mir-143-5p相互作用的调节机制；并初步确定了lncrna的表达谱和与胰腺癌相关的基因，为胰腺癌治疗提供一个潜在靶点。
研究内容及结果
1.在胰腺癌和癌旁组织中linc01207、mir-143-5p和agr2表达水平的变化
首先通过免疫组化检测agr2蛋白的表达情况，在光学显微镜下agr2蛋白的阳性表达显示为棕黄色，且在癌组织中的蛋白阳性率大于癌旁组织（图1a-1c），可初步得到在胰腺癌中agr2蛋白表达上调。
接着通过分析胰腺癌的基因综合表达谱（geo），其热图数据显示出agr2确实是显著上调的基因（图2a-2d）；进一步分析微阵列gse16515数据库，发现linc01207变化与agr2呈正相关（图2e-2f）；再通过rt-qpcr检测得到在胰腺癌中linc01207和agr2高表达、而mir-143-5p低表达（图2g）。
图1 胰腺癌组织中agr2的阳性表达上调
图2 前列腺癌中circrnas的表征和鉴定
2.互作实验验证出mir-143-5p可特异性与linc01207和agr2结合
调取出rna22网站中linc01207与mir-143-5p、mir-143-5p与agr2的预测结合位点信息（图3a-3b）；构建双荧光素酶的报告基因，发现linc01207-wt与mir-143-5p mimic、agr2-wt与mir-143-5p mimic共处理时均显著地降低了荧光素酶活性（图3c-3d）；再通过rna pull-down和rip-qrcp正反验证实验，得出linc01207和mir-143-5p的结合关系以及mir-143-5p和agr2的靶向关系。
图3 mir-143-5p可特异性与linc01207和agr2结合
3. 初步探究linc01207、mir-143-5p和agr2的调控机制
通过rt-qpcr和wb检测了在五个细胞株中agr2的表达情况，筛选出最佳的mpanc-96细胞株供进一步应用（图4a-4c）。接下来，采用rt-qpcr分析mpanc-96细胞株中linc01207、mir-143-5p和agr2的表达模式，得到沉默linc01207可以降低linc01207与mir-143-5p结合情况，进而导致mir-143-5p高表达和agr2低表达（图4d）。
图4 选择mpanc-96细胞株来探究linc01207、mir-143-5p和agr2的调控机制
4.深度探究linc01207、mir-143-5p和agr2的调控机制
一方面，采用免疫荧光染色检测lc3ii的表达情况，得到sirna-linc01207和mir-143-5p mimic治疗后lc3ii蛋白表达升高、dylin 488染色结果呈点状的绿色荧光，而mir-143-5p inhobitor治疗后lc3ii蛋白表达降低（图5a）；同时发现sirna-linc01207 + mir-143-5p mimic共转染后具有更高的lc3ii表达量（图5b）。
另一方面，采用免疫印迹法检测自噬和凋亡相关蛋白（lc3ii、p62、beclin-1、bcl-2、bax、agr2，内参gapdh），同上组别间的趋势比较，得出沉默linc01207和过表达mir-143-5p可增加lc3ii、beclin-1蛋白表达，同时降低p62、agr2蛋白表达和bcl-2/bax蛋白比率，从而诱导胰腺癌细胞自噬和凋亡（图6a-6b）。
图5 抑制linc01207和升高mir-143-5p可促进胰腺癌中lc3ii的表达
图6 抑制linc01207和升高mir-143-5p可促进胰腺癌细胞凋亡和自噬
5.细胞功能学验证了抑制linc01207和升高mir-143-5p对胰腺癌细胞生长的影响
首先采用mtt法检测细胞生长情况，生长曲线显示sirna-linc01207 + mir-143-5p mimic联合治疗对胰腺癌细胞的生长有较强的抑制作用（图7a）。其次采用tunel染色法检测细胞凋亡情况，在高倍镜下选择200个细胞计算阳性细胞的百分比，统计结果显示80nm sirna-linc01207单独或与mir-143-5p mimic联合治疗能显著地促进胰腺癌细胞凋亡（图7b-7c）；同时采取流式细胞术也得到了一致的结果（图7d）。最后采用吖啶橙染色来计算酸性自噬囊泡细胞的比例，通过在荧光显微镜下观察和统计，得到sirna-linc01207 + mir-143-5p mimic联合治疗可促进胰腺癌细胞自噬（图7e-7f）。总的来说，抑制linc01207和升高mir-143-5p能促进胰腺癌细胞的凋亡并引起自噬效应。
图7 细胞功能学验证linc01207和mir-143-5p对胰腺癌细胞生长的影响
文章小结
本文旨在探究linc01207在肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭中作用机制，通过胰腺癌的基因综合表达谱（geo）筛选出显著上调的基因agr2；再根据gse16515数据集和分子验证得到linc01207变化与agr2呈正相关；然后测定胰腺癌和癌旁组织中agr2、linc01207和mir-143-5p的表达模式，并验证出linc01207和mir-143-5p的结合关系以及agr2和mir-143-5p的靶向关系；最后通过自噬和凋亡相关的细胞功能指标进一步确认机制。综上所述，本研究提供了一个新的视角，沉默linc01207即可通过削弱以mir-143-5p为靶向的agr2表达来抑制胰腺癌的进展，为临床治疗提供一个新的视角。
解析文献
liu c, wang jo, zhou wy, et al. long non-coding rna linc01207 silencing suppresses agr2 expression to facilitate autophagy and apoptosis of pancreatic cancer cells by sponging mir-143-5p. mol cell endocrinol. 2019 apr 13. doi: 10.1016/j.mce.2019.04.004.