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免疫沉淀(ip)常见问题解答
文章来源:genecreate 作者:genecreate 发布时间:2018-12-28 09:36
刚开始做免疫沉淀(ip)的时候肯定会出现各种状况,遇到很多问题,下面我们整理了ip常出现的问题,并附上了凯发k8网页登录的解决方案。 
 
首先,当然是做出来的背景很高,可能存在的原因有如下:
 
1.洗涤不够充分
凯发k8网页登录的解决方案:在加入洗涤剂洗涤的时候,应当盖上管盖反复颠倒数次,动作应当轻柔,但次数要有保证,接着在放到离心机里离心。
 
2.去垢剂不溶性蛋白残留
凯发k8网页登录的解决方案:加入上样缓存液,煮5分钟左右,而后离心,吸取上清进行wb
 
3.非特异性蛋白和珠子产生结合
凯发k8网页登录的解决方案:珠子应用bsa充分预封闭,确保bsa新鲜。具体方法为,新鲜琼脂糖珠玉1%bsa(pbs溶解)孵育1h,使用前再用pbs洗涤3-4次。
 
4.抗体特异性不够
凯发k8网页登录的解决方案:使用可以做ip的抗体,阅读文献购买适合做ip的抗体,根据文献报道的加入抗体的量进行ip。
 
5.抗体过多引起非特异性结合
凯发k8网页登录的解决方案:一般目的蛋白直接的binding比较稳固时,减少抗体的使用量,具体可以参考直接的推文。
 
6.蛋白样品中蛋白浓度过高(尤其是在细胞系上转染过表达两种蛋白质)
凯发k8网页登录的解决方案:用裂解液适当地稀释蛋白样品,或者可以选择目的蛋白有表达的细胞系,不做转染,直接收蛋白做ip。
 
7.ip过程中抗原降解
在裂解液中一定要加入适当的蛋白酶抑制剂,尤其是对于含多个基团(如糖基化)的蛋白,更应当注意在冰上操作和4度离心。
 
相反,大家可能还会遇到一个问题,那就是没有检测到目的蛋白,原因如下:
 
1.用的细胞或者组织样品中本身不表达或者低表达这个蛋白,可以换一种该蛋白高表达的细胞系或者组织,重新进行ip
 
2.抗体量加的太少,导致不能结合到更多的抗原,应当增加抗体浓度。
 
3.目的蛋白没有从珠子上洗脱下来,此时,首先应确定洗脱缓冲液的质量是否良好,另外可以尝试其他的洗涤剂。
 
4.抗体没有结合到珠子上,此时,应当确保使用的珠子与抗体亚型是一致的。
 
5.细胞或组织没有裂解完全,或者完全没有裂解。此时,应当检查裂解液是否已经失效,可以重新配置,再进行ip。
 

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