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rna pull down—研究rna与蛋白互作的法宝
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2018-05-10 14:35
rna与蛋白质的相互作用是细胞生理过程得以实现的决定性因素之一。近年来，随着技术的改进和新方法的建立，rna和蛋白质的相互作用研究取得了长足进步。目前科研人员已经鉴定了较多rna上的蛋白质结合位点，也发现了许多蛋白质中的rna结合结构域，并对它们的结构特征进行了比较详细的研究。这些为最终探明rna和蛋白质相互作用的分子机制，从而从本质上认识相关的细胞生理过程打下了坚实的基础。
rna pull-down作为研究rna与蛋白互作的核心技术，已成为研究焦点。rna pull down是使用体外转录法标记生物素rna探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成rna-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过wb实验检测特定的rna结合蛋白是否与rna相互作用，或者结合ms筛选rna结合的未知蛋白。
rna pull down技术应用
1.癌症肿瘤相关调控机制研究
lncrna发挥功能的方式很广，可以与蛋白、dna和rna相互作用，参与多种生物学过程的调控。主要包括基因组表观遗传修饰、调控转录后翻译、发挥cerna、增强子rna作用等，从而对细胞的增殖、分化、迁移、凋亡、免疫等发挥调控作用。
lncrna能够通过对肿瘤细胞糖代谢、谷氨酰胺代谢和脂类代谢途径中的关键环节进行调节，导致肿瘤细胞对葡萄糖摄取增加、谷氨酰胺分解增强及脂质生成增加，从而促进肿瘤的发生和发展。目前，大多数lncrna在肿瘤细胞能量代谢中的功能和调控机制尚不完全清楚，进一步认识和了解肿瘤细胞中与lncrna相关的能量代谢异常表现出的恶性生物学行为，将有助于为肿瘤的诊断和治疗提供有效的证据及新的思路和途径。
环状rna（circular rna，circrna）是近来研究很热门的一种特殊的长链非编码rna。研究发现，circrna 在人体细胞中广泛表达，在转录后水平具有调控基因表达的重要功能，并且参与多种肿瘤和其他疾病的病理发展过程
circrna大多由外显子序列组成，呈闭合环状结构，性质稳定，高度保守性，通过微小rna“海绵”作用调控靶基因表达，与肿瘤的发生、发展相关。这些特性使circrna有潜力成为肿瘤新型分子诊断标志物。通过竞争性与肿瘤相关微小rna的结合，可以开发针对circrna分子靶点的靶向治疗药。因此,circrna在肿瘤转化医学研究中意义巨大。
2.多种人类疾病研究
rbps在转录后水平参与调控mrna稳定性、lncrna活性、应激、肿瘤发生发展、细胞凋亡等众多生物学过程，且与诸多人类疾病密切相关。因此，对rbps-rnas相互作用网络的研究和鉴定有重要意义。但由于rbps作用方式复杂、功能多样性、作用空间位置多样化等原因，对其开展精确研究一直是一个重大挑战。rna领域，尤其是非编码rna研究的快速发展，催生了多种rbps-rnas相互作用鉴定技术。
| 问题 | 原因 | 凯发k8网页登录的解决方案 |
| rna结合蛋白的亲和力不够 |
1）结合缓冲环境没有优化 2）裂解不完全 3）磁珠用量不足 4）rna探针用量不足 |
1）优化孵育时间、温度 、盐浓度等条件 2）增加裂解液和蛋白上样量的比例 3）增加裂解液 4）增加磁珠或探针用量 5）确定生物素和链霉亲和素效率 |
| rna结合蛋白没有结合 |
1）靶蛋白量不足 2）缓冲体系不对 3）rna探针和蛋白的亲和力本来就低 |
1）增加上样蛋白量 2）应用低盐体系 3）加入交联试剂 |
| wb信噪比高 |
1）阳性信号率低 2）一抗效率低 3）蛋白没有充分溶解 |
1）增加二抗的量 2）用敏感度的化学发光液 3）用细胞裂解液预孵一抗 4）增加样品的量 5）确定有没有其他可能的结合情况 6）增加裂解液用量 |
| 结合的非特异性高 |
1）缓冲环境没有优化 2）缓冲环境严谨性低 3）样品没有裂解完全和裂解体系没有优化 |
1）优化孵育时间温度 盐浓度等条件 2）使用严谨性高的缓冲体系 3）调低rna探针和样品的比例 4）提高裂解液的量 |
案例展示
案例一
题目：the stat3-binding long noncoding rna lnc-dc controls human dendritic cell differentiation
小结：rna pull-down设置实验组及反义链对照组，银染找出差异条带进行胶条质谱鉴定，分析结果筛选得到stat3蛋白，进一步通过rip-qpcr反向验证，证实stat3蛋白可以与lnc-dc结合。
lnc-dc pull-down银染检测及rip验证lnc-dc与stat3互作
案例二
题目：the long noncoding rna thril regulates tnfα expression through its interaction with hnrnpl
小结：先用linc1992全长进行rna pull-down实验，通过wb检测手段分析四个意向蛋白中筛选得到一个差异蛋白α-hnrnpl，通过分段rna pull-down及wb分析核心结合区域，主要是linc1992的1-699和1406-2012区域，通过rip-qpcr反向验证，证明α-hnrnpl蛋白可以与linc1992结合。
linc1992 pull down-wb筛选差异蛋白同时结合rip验证linc1992与α-hnrnpl互作
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