技术专题
crispr触发的内源oct4或sox2基因位点染色质重塑激活细胞重编程
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2018-03-07 13:58
题目：crispr-based chromatin remodeling of the endogenous oct4 or sox2 locus enables reprogramming to pluripotency
期刊：cell stem cell
影响因子：23.394
主要技术：crispr-dcas9-vp64激活系统、诱导性多能干细胞构建、原代细胞制作、ips鉴定
研究背景
终末分化的成体细胞逆分化，形成多能干细胞状态的过程称为细胞重编程（cell reprogramming）。在2006年，日本科学家山中伸弥（shinya yamanaka）发表诱导性多能干细胞（ips, induced pluripotent stem cells）构建技术，利用逆转录病毒，把oskm（oct4, sox2,klf4 and c-myc）四因子在体细胞中进行超表达，成功把小鼠胚胎成纤维细胞诱导形成多能干细胞，开辟了一个全新的干细胞研究领域。随着研究的深入，人皮肤成纤维细胞、t淋巴细胞等也被成功诱导成多能干细胞。而这些多能干细胞与供体dna是保持一致的，且有分化成多种细胞的潜力，展现出非常广阔的临床应用前景。如把人血液中的t淋巴细胞逆分化形成多能干细胞后，当定向分化技术成熟时， ips能被有序分化成需要的细胞，比如心肌细胞、神经细胞等。
染色体上重要的基因启动子位点的表观遗传学变化，如dna甲基化水平变化、组蛋白乙酰化水平变化、染色质重塑等，开启重要基因如oct4, sox2等的内源性表达，是ips诱导过程中至关重要的事件，直接关系到诱导是否成功。
系统作为一种强大的基因编辑工具，现今已广泛用于常规的细胞或者个体的基因敲除、基因敲入、点突变外。当cas9蛋白进行失活改造以及结构域添加后，得到crispr-dcas9-suntag-vp64系统，则能实现特异基因转录激活。crispr-dcas9内源基因激活技术（suntag gene activation），正好与ips诱导技术完美契合，解决了激活内源oskm四基因的问题，从而诞生了新型的ips构建策略（见图1）。
图1. 利用cripr-dcas9基因激活系统的ips诱导策略
研究内容及结果
1. 设计定位于sox2和oct4基因启动子区和oct4增强子区的sgrna，利用crispr-dcas9-suntag-vp64对sox2和oct4进行激活。
本研究首先设计了相应基因靶标的sgrna，启动子区或者增强子区靶标位置考虑因素包括：sgrna靶标位置与重要的转录因子（oct4、sox2、nanog）结合位点、组蛋白乙酰转移酶p300结合位点的距离，靶标区附近组蛋白乙酰化分布、dna甲基化分布等。并以mef细胞为材料，在rna水平检测了不同sgrna对靶标基因sox2和oct4的激活效果（图2）。
图 2. mef细胞中，sox2和oct4基因启动子区和oct4增强子区不同sgrna的转录激活效果验证实验
2. crispr-dcas9-suntag-vp64系统对重要基因进行内源激活，能成功获得ips.
随后，同样使用此方法，利用筛选出来18个有效sgrna，分别激活7个重要基因: oct4, sox2, klf4, c-myc, nr5a2, glis 1, cebpa。将mef利用病毒感染方法进行18 sgrna导入后，与dcas9-suntag-vp64形成复合体，激活了og2-mef中相应内源基因的表达，经过17天的诱导后，成功得到了ips细胞，并稳定传代，且显示出与胚胎干细胞相同的克隆形态。通过免疫荧光和qpcr，显示得到的ips表达nanog, sox2和ssea-1，相关干细胞基因表达水平与ri胚胎干细胞相比，均相当或者超过。此部分证明crispr-dcas9-suntag-vp64系统进行内源激活时，能成功实现ips诱导（图3）。
图3. crispr-dcas9-suntag-vp64系统同时激活oct4, sox2, klf4, c-myc, nr5a2, glis 1, cebpa内源表达时，能成功实现ips诱导
3. crispr-dcas9-suntag-vp64系统单独对sox2基因进行内源激活，也能有效获得ips
研究者单独选取了能对sox2进行激活的sgrna进行ips诱导，发现在有效激活内源sox2基因表达的情况下，能成功得到诱导性多能干细胞，并能稳定增殖传代。得到ips通过体内体外实验，如干细胞基因表达情况检测实验（免疫荧光、qpcr等）、囊胚注射实验等，在囊胚注射实验后，还得到了嵌合体小鼠，并能稳定地生殖传递，后代中得到og2小鼠品系的小鼠。这些实验证明了ips细胞系的完整干性：稳定自我更新能力和多向分化能力（图4）。
图4. crispr-dcas9-suntag-vp64系统单独激活sox2内源表达时，能成功实现ips诱导
4. crispr-dcas9-suntag-vp64系统同时对oct4基因启动子区和增强子区进行内源激活，能有效获得ips
接下来，研究者选取靶标位置为oct4启动子区或者增强子区的sgrna进行诱导实验，发现单独利用oct4启动子区的sgrna或者增强子区sgrna对oct4基因进行激活时，虽然表达激活，但内源强度无法得与胚胎干细胞系r1相比。在诱导过程中，单独的sgrna无法得到ips。oct4启动子区的sgrna或者增强子区sgrna进行组合时，内源oct4表达强度得到了很好的提升，最终得到ips，并能稳定增殖传代。得到ips通过体内体外实验，如干细胞基因表达情况检测实验（免疫荧光、qpcr等）、囊胚注射实验等，在囊胚注射实验后，还得到了嵌合体小鼠，并能稳定地生殖传递，后代中得到og2小鼠品系的小鼠。这些实验证明了ips细胞系的完整干性：稳定自我更新能力和多向分化能力（图5）。
图 5. crispr-dcas9-suntag-vp64系统同时对oct4基因启动子区和增强子区进行内源激活能有效获得ips
文章小结
作为利用crispr-dcas9激活系统进行ips构建，作者非常有力地证明了crispr-dcas9-suntag-vp64系统对构建ips的有效性。可以预见，后续的mef直接诱导形成心肌细胞、神经细胞的研究中，此系统很可能也有一席之地。此文章既进行了相关技术方法探索，也回答了一个非常好的科学问题：ips诱导过程中，相关内源基因的表观遗传学变化直观重要。
在表观遗传学研究中，cripsr-dcas9激活内源基因表达的应用，会相对广泛一些。crispr-dcas9-suntag-vp64系统稍加改进，很可能是直接改变相关基因表观遗传学特征的利器。
解析文献
p. liu, m. chen, y. liu, l.s. qi, s. ding. crispr-based chromatin remodeling of the endogenous oct4 or sox2 locus enables reprogramming to pluripotency, cell stem cell, 22 (2018) 252-261.
参考文献
1. black, j. b., adler, a. f., et al. (2016) targeted epigenetic remodeling of endogenous loci by crispr/cas9-based transcriptional activators directly converts fibroblasts to neuronal cells. cell stem cell 19, 406-414
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