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双荧光素酶报告基因的应用,常见载体及案例简介
文章来源:未知 作者:genecreate 发布时间:2022-11-01 14:31

        双荧光素酶报告基因检测(dual-luciferase reporter assay)通常以萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)为报告基因,以海肾萤光素酶(renilla luciferase)为内参基因。所构成的报告系统具有灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势,广泛用于基因调控、非编码rna靶向互作等研究领域。
        firefly luciferase(简称f-luc)以荧光素(luciferin)为底物,在mg2 、atp和氧分子存在条件下,催化luciferin氧化成oxyluciferin,在此过程中发出最强波长在560nm左右的生物荧光(bioluminescence)。f-luc表达框的上游启动子区域插不同功能序列,可以通过转录起始条件造成其报告荧光的变化。在f-luc的3’utr区域插入待验证的靶序列,通过其翻译抑制或mrna稳定性降低,可以反映是否存在靶向互作。
        renilla luciferase(简称r-luc)以腔肠素(coelenterazine)为底物,在氧分子存在的条件下催化coelenterazine氧化生成coelenteramide,此过程中发出最强波长在465nm左右的生物荧光。r-luc通常由固定组成型启动子驱动,在报告系统中作为校正input误差的内参信号。
 

生物荧光产生反应式                            
 
一、应用方向
1. 验证microrna同mrna靶向互作。将待测mrna的3’utr序列插入报告基因载体,再共转入该microrna,如果荧光素酶活性下降,则提示为其靶序列。
2. 验证microrna同lncrna靶向互作。将候选的lncrna序列插入报告基因载体中f-luc的3’utr区域,检测荧光素活性。
3. 启动子结构分析。将启动子区域序列(通常2k左右)进行分段截短,或对特定位点进行突变,再分别构建入luciferase报告载体,检测其启动子活性。
4. 启动子snp分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性,可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。
5. 验证特定转录因子同其调控序列的作用。将该序列(通常为启动子区域)插入报告基因载体,同时在实验细胞中共转过表达该转录因子,可分析转录因子过表达是否提高光素酶活性。
6. 可以分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体,在不同上游信号条件下,荧光素酶活性代表了通路的下游响应。例如,在gpcr研究中,将camp response element(cre)载入报告基因载体,构建稳定表达细胞株后,可以用于分析gpcr的激活与抑制剂筛选。又如,将hif1α的响应原件hypoxia-responsive element (hre)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株,可以用于低氧相关通路的研究。
 
 
二、常用荧光素酶报告基因载体
         
pgl3-basic                           
 
            
prl-tk                               
 
            
pmirglo                            

 

三、经典案例

案例一
题目:long non-coding rna linc00673 regulatednon-small cell lung cancer proliferation,migration, invasion and epithelialmesenchymal transition by spongingmir-150-5p
期刊:molecular cancer
小结:验证linc00673具有mir-150-5p的靶向结合位点。将linc00673包括预测结合位点的序列克隆到pmirglo- linc00673-wt,同时构建靶位点突变的pmirglo- linc00673-mut,分别共转mir-150-5p mimics及nc mimics,结果显示mir-150-5p转染组的相对荧光值降低,提示存在靶向结合。
 
          
                                
图:rna与质粒共转染293t,24h后双荧光素酶检测            
案例二
题目:sox9 indirectly regulates ceacam1 expression and immuneresistance in melanoma cells
期刊:oncotarget
小结:验证sox9对于ceacam1的转录调控作用。分别使用了两种黑色素瘤细胞526mel和624mel,对ceacam1的启动子区域分别选择了600bp-200bp的截短片段,共转染过表达sox9,显示sox9能够抑制ceacam1启动子的转录。
 
       
图:截短的pceacam1进行双荧光素酶检测              
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