分子互作专栏 | 基因与基因互作-凯发k8网页登录

    分子互作是生命体的普遍主题，分子互作技术作为生命科学的基础技术现已广泛应用于生命科学研究的方方面面。本文是分子互作专栏的第一篇文章，主题是“基因与基因互作”。

 

双荧光素酶实验-原理

    萤火虫荧光素酶可以催化荧光素氧化成oxyluciferin，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光，生物荧光可以通过酶标仪进行测定。

    海肾荧光素酶可以催化腔肠素氧化成coelenteramide，在腔肠素氧化的过程中，会发出生物荧光，生物荧光可以通过酶标仪进行测定。

    先以荧光素为底物来检测萤火虫荧光素酶，后以肠腔素为底物来检测海肾萤光素酶，并且在后续加入腔肠素时，同时加入抑制萤火虫荧光素酶催化荧光素发光的物质，使后续检测仅仅检测到海肾荧光素酶的活性，实现双荧光素酶报告基因检测。通过荧光素酶和其底物这一生物发光体系，可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。

    把感兴趣基因的5’启动子区克隆在荧光素酶的上游，或把3’-utr区克隆在荧光素酶的下游等，构建成报告基因(reporter gene)质粒。然后与转录因子表达质粒，或mirna mimics共转染细胞，裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低来判断转录因子或mirna对目的基因的转录调控作用。

    海肾荧光素酶相对更多地被用作转染效率的内参，以消除细胞数量和转染效率的差异。萤火虫荧光素酶催化荧光素发光的最强发光波长为560nm；海肾荧光素酶催化腔肠素发光的最强发光波长为465nm。

应用案例
1、双荧光素酶应用之验证转录因子与启动子互作
    例：验证e2f1转录因子与il6启动子互作（pmid：32044038）

    首先在ensembl网站( asia.ensembl.org/index.html )查找il6启动子序列，其次在jaspar网站( jaspar.genereg.net/ )预测互作。

 

实验材料

    细胞：293t或客户指定细胞（客户指定细胞系不保证转染效率）

    质粒：

      ①转录因子序列构建到pcdna3.1；

      ②启动子序列构建到pgl3-basic；（互作位点200bp左右）

      ③内参质粒prl-tk。

2、双荧光素酶应用之验证mirna与mrna互作

    例：验证has-mir-1270与cenpm 3’utr互作（pmid：31703591，if=4.357）

    在starbase网站预测互作

 

注意事项

    qa及送样注意事项

     荧光素酶报告基因检测常见问题与解答

      q: 荧光素酶报告基因检测主要有哪些用途？ 

      a.启动子结构分析，将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。

      b.启动子snp分析，一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。

      c.验证特定转录因子同其调控序列的作用，将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高荧光素酶活性。

      d.可以分析信号通路是否激活，将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，荧光素酶活性代表了通路的下游响应。例如在gpcr研究中，将camp response element（cre）载入报告基因载体，构建稳定表达细胞株后，可以用于分析gprc的激活与抑制剂筛选。又如，将hif1α的响应原件hypoxia-responsive element (hre)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株，可以用于低氧相关通路的研究。

      e.验证microrna的靶序列，将待测的3’utr序列插入报告基因载体，再共转入该microrna，如果荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。

 

      q : 在金开瑞做荧光素酶报告基因检测，需要提供什么？实验结果包括哪些？

      您需要提供：1.基因序列或者模板，需提供详细的转录因子、目的基因或microrna信息；2.实验细胞，如无特殊要求，金开瑞默认为使用293t细胞，则无需提供（金开瑞暂时只开展293t细胞的双荧光素酶实验）。

      实验结束后，金开瑞会为您提供实验流程及完整报告一份，包括实验原始数据、图片、分析结果等。

 

      q: 荧光素酶作为报告基因相比于荧光蛋白有哪些优势？

      luciferase的灵敏度相比于gfp提高10-100倍以上，同时具有更宽的动态范围，便于数值分析比较，不需要荧光显微镜，而且在活体实验中其荧光穿透性高于egfp等荧光蛋白，同时由于没有内源活性、其本底信号很低。

      而gfp等荧光蛋白相比于荧光素酶的优势在于可以进行失踪定位，并且其观测不需裂解细胞，方便进行适时观察。

 

      q : 海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶相比，相对活性如何？

      在氧、镁和atp的存在下，萤火虫荧光素酶作用于萤火虫荧光素，而来源于海洋腔肠（renilla reniformis)的荧光素酶在氧的存在下作用于海肾荧光素。双报告基因技术（dual-reporter assays）,结合了萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试。

 

      q : 双荧光素酶报告基因实验转染效率很低而且复孔重复不出来是什么原因？

      转染效率低的话可以从三个方面改善，首先要确保细胞状态是好的，通常我们选出处于分裂期的细胞，另外阳性对照您可以选择过表达的荧光蛋白质粒，还有就是dna的质量尤为重要，最好是先酶切验证。

      这个实验检测结果很灵敏，有一定差异是正常的，通常只要确保它在一个数量级之内即可。如果差异超出这个范围可以从两方面改善，一是记住保持样本的均一性，二是加样要准确。

 

限时活动

    双荧光素酶检测服务限时大促将于6月30日截止，感兴趣的客户可以参与噢：

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