书接上文，上回我们聊到了，这期我们来唠一唠膜体系酵母双杂载体怎么选择。

dual membrane 系统(dual membrane system)首先由瑞士的dualsystems biotech ag 公司开发出来，是基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统。可介导蛋白降解的泛素(ubiquitin)被分为：

①cub（c端结构域）

②nub（n端结构域）：第三位的i被突变为g得到nubg，nubg在bait和prey互作下结构重构，与cub发生互作

膜蛋白酵母双杂交-dualsystems split ubiquitin原理是：

cub与lexa-vp16转录激活因子连接成cub-lexa-vp16，当bait-cub-lexa-vp16与prey-nubg可互作时，cub与nubg在空间上接近发生重构，被泛素特异性蛋白酶ubps识别，lexa-vp16被解离进入核内，使启动子下游基因（抗性筛选、蓝白斑筛选、营养缺陷型筛选等）得到转录。

膜体系酵母双杂选择载体是根据诱饵蛋白质定位的不同来选择，有利于互作蛋白相连的泛素nubg和cub-lexa-vp16相互作用，被ubps识别，从而启动下游报告基因表达。主要分为以下几种情况：

1. 若诱饵蛋白的n端在胞质，c端在细胞器腔内（或者胞外），建议用pbt3-n载体构建诱饵。

2. 若诱饵蛋白是c端位于胞质，n端位于细胞器腔内（或者胞外），且n端含有信号肽，选择载体pbt3-suc构建诱饵重组质粒，这是因为某些哺乳动物细胞的信号肽在酵母中无法识别，而pbt3-suc中含有一段酵素转化酶（suc2）基因序列，当其定位在诱饵蛋白n端，能够确保诱饵蛋白正确定位到酵母细胞膜上。

图片来源于dual membrane pairwise interaction kit user manual

从载体的图谱上中可以看出，cdna插入位点（sifi位点）的上游是suc2，下游是cub-lexa-vp16。这样表达后诱饵蛋白n端就含有suc， c端含有cub-lexa-vp16，诱饵蛋白就能够定位在膜上，并且和互作蛋白的nubg相互作用。

3. 若诱饵蛋白是c端在胞质，n端在细胞器腔内（或者胞外），且n端不含信号肽，推荐使用pbt3-ste。

4. 如果你的诱饵蛋白n端c端均位于胞质，则pbt3-n和pbt3-ste都可以选择。

5. 膜体系的猎物（prey）载体分别为ppr3-n和ppr3-c。nubg在猎物蛋白n端时建议用ppr3-n。nubg在猎物蛋白c端时采用建议用ppr3-c。

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