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超详细!手把手教你做rna pull down
文章来源:genecreate 作者:genecreate 发布时间:2020-12-03 15:16
        在之前的文章中我们已经了解了rna pull down 实验的原理、应用、案例和注意事项(回顾点这里),今天我们来唠一唠rna pull down 实验的详细步骤~
rna pull down 实验步骤
1、构建 rna 过表达质粒:基因合成 测序验证;
2、体外转录模板准备:设计含 t7 启动子引物,pcr 扩增得到转录模板;
3、体外转录:以 pcr 产物为模板,体外转录得到目的 rna;
4、rna pull down :通过磁珠 -rna 探针复合物富集互作的蛋白;
5、银染质检:sds -page 电泳银染检测富集蛋白的情况 ;
6、质谱鉴定:通过质谱鉴定实验组与对照的差异蛋白;进而筛选可能的互作蛋白。
 
一、构建rna过表达质粒
1、首先通过其他手段筛选确定自己感兴趣的 rna (以 下讲解lncrna 为 主);检索数据库找到对应的 rna 碱基序列;
2、再通过 race 扩增是否存在未知序列,由于 lncrna-race 成功率非常低, 尝试扩增后再确定 rna pull down 使用的序列;
3、确认 rna pull down 使用的序列后,设计引物全基因合成目rna 序列, 构建到 pcdna3.1(载体可以根据其他实验灵活替换)过表达中,并测序验证序列准确性;
4、最后提取过表达质粒备用。
 
二、体外转录模板准备
实验分组:
实验组:sense 链即目的 rna 序列
对照组:antisense 链即目的 rna 互补序列
引物设计方法:
在正向引物前面加入 t7 启动子序列;反向引物不变。
以构建过表达质粒为模板 设计合成好的引物,扩增得到体外转录模板,琼脂糖凝胶电泳检测扩增 pcr 产物情况,切取目的条带纯化回收备用。
rna pull down
 
三、体外转录
1、以纯化回收的 pcr 产物作为转录模板,用体外转录试剂盒进行转录得到目的 rna (含 sense 及antisense 两组);
2、不同试剂盒转录情况(转录rna 大小、转录 rna 量等等)会有所不同。
 
四、rna pull down
1、蛋白液提前准备:
优先选择细胞系:pull -down 实验前需要提供对应的细胞系,扩大培养后收集细胞裂解提取总蛋白备用;
组织样品作为备选:动物或者植物组织液氮研磨后超声裂解提取总蛋白备用。由于组织样品需要前处理,且其中包含很多杂质可能会对磁珠富集产生影响,最终影响富集效率导致富集蛋白量较少,进而影响最终鉴定结果。
2、以上体外转录得到的 rna ,标记生物素后纯化备用;
3、标记生物素 rna 探针与链霉亲和素磁珠共孵育形成复合物;
4、生物素 rna 探针 -链霉亲和素磁珠复合物富集蛋白;
5、富集蛋白洗脱保存。
 
五、银染
电泳→固定→致敏→染色→显色→终止
 
六、质谱鉴定
rna pull down 富集蛋白质谱通常选择胶条鉴定。
根据银染结果来选择质谱鉴定的方式:
a、存在肉眼可见差异条带:
切取 sense 实验组泳道中的差异条带进行胶鉴定。当差异条带非常多时,节约质谱费用也可以选择  sense 和 antisense 两组蛋白液分别进行质谱。
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b、无肉眼可见差异条带:
将sense 实验组和 antisense  对照组两蛋白液分别进行全谱鉴定,根据鉴定分析结果找出 sense 实验组中特有的蛋白,进而筛选与自己研究相关的蛋白进行后续验证。
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c、存在浓度差异条带:
也将 sense  实验组和 antisense 对照组两蛋白液分别进行全谱鉴定, 根据鉴定分析结果找出 sense 实验组中特有的蛋白,进而筛选与自己研究相关的蛋白进行后续验证。
rna pull down
 
七、验证实验
根据 rna pull -down 质谱鉴定分析结果,筛选与自己研究相关的可能互作蛋白。
购买对应蛋白 ip 级别抗体;或者构建标签重组过表达质粒 /慢病毒处理细胞。使用目的蛋白抗体或者标签进行 rip -qpcr实验反向验证。
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八、直播预告
12月1日(周二)20:00
直播教你做rna pull down
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