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知无不“研”，dna pull down 常见疑点解析
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2020-11-17 10:11
dna pull down 常见疑点解析
q1： 适配子dna单链，可以用带有互补链的磁珠进行pull down吗？如果可以，效率怎么样？一般需要怎么优化条件？
a：理论上说,若dna单链能够与磁珠上的互补链杂交成功,是可以进行pull down实验的; 效率如何不好确定,这个取决于两条dna单链是否能杂交成功、蛋白-dna结合的强弱、蛋白的丰度等。
q2： dna pull down的 原理？
a：针对目标区域设计特异性dna探针并进行生物素标记，生物素探针可与偶联在磁珠上的链霉亲和素结合；细胞蛋白提取物与磁珠-dna探针孵育，从而钓取与dna探针有特异性结合的互作蛋白质。
q3： 你们对外服务的检测项目有哪些？
a：细胞、动物/植物组织、菌体都可以做dna pull down, 我们还可以做的检测实验具体如下:
(1) rna-蛋白/rna互作及定位：rna pull down、rip、fish等;
(2) dna-蛋白互作：dna pull down、chip、emsa、双荧光素酶、酵母单杂等;
(3) 蛋白-蛋白互作：gst/his pull down、coip、酵母双杂等;
(4) 细胞学检测：细胞增殖-mtt/cck-8, 细胞凋亡, 细胞周期,细胞迁移、侵袭：划痕愈合/transwell/transwell（matrigel）等;
(5) 外泌体服务：提取、鉴定(nanosight粒径检测/电镜/wb)、
测序(mirna/lncrna)、蛋白质组学;
(6) 转录组及蛋白质组：真核有参转录组、无参转录组、真核lncrna、small rna等。
q4：效率有多高？
a：效率主要取决于蛋白-dna结合的强弱、蛋白的丰度等。
q5：老师，对照组的dna序列是怎么选择的？
a：一般对照组是没有探针的,对照组是磁珠beads 蛋白。
q6：dna pull down有什么缺陷吗？
a：dna pull down-ms是体外研究蛋白-dna是否有直接互作的经典技术，是将探针结合在凝胶/磁珠上，钓取与dna探针有互作的蛋白；就技术而言,没有明显的缺陷;后续质谱能鉴定到多少蛋白取决于蛋白-dna结合的强弱、蛋白的丰度等。
q7： 做dna pulldown 用dna单链好还是双链好？
a：常规的是用dna双链作为探针。
q8： 可以简单讲一下生物素标记引物的原理吗？
a：主要利用生物素（biotin）和亲和素（avidin）这两种分子的独特性质; 亲和素的每个亚基都能结合一个生物素分子,两者的结合是通过生物素的脲基环部分完成的;因此可将其戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。
q9： 如果做转录因子，转录因子和dna结合发起转录，不应是和打开的单链结合吗?
a：启动子是位于转录起始位点（结构基因）5'端上游的dna序列，就像"开关"，决定基因的活动，本身并不控制基因活动，而是通过与特定蛋白质（转录因子）结合而控制基因的活动。转录因子就像一面"旗子"，指挥着酶(enzymes)(rna聚合酶polymerases) 的活动，这种酶制造着基因的rna复制本。转录因子是与启动子dna双链结合的。
q10：做100bp突变对照组应该怎么突变碱基？
a：可以通过查找相关资料确定启动子发挥功能的核心区域,将核心区域进行突变;一般是a/g互换,c/t互换突变。
q11： dna互补链可以相互钓取吗？
a：dna pull down 是研究蛋白-dna的互作,不可以用dna互补链相互钓取。
q12：请问dna为什么会与蛋白质互作呢，它们有什么功能的联系吗？
a：dna pulldown 是研究蛋白-dna的互作, 主要应用于寻找已知的启动子序列所结合的未知蛋白（转录因子）；启动子是位于转录起始位点（结构基因）5'端上游的dna序列，就像"开关"，决定基因的活动，本身并不控制基因活动，而是通过与特定蛋白质（转录因子）结合而控制基因的活动。
q13： 如果做小肽对细菌的作用是否也可以dna pull down？
a：小肽属于蛋白类, 做不了dna pull down。
q14：未加探针的对照组鉴定出蛋白是什么原因呢？
a：对照组是磁珠beads 蛋白，虽然没有探针，但少量蛋白可以与磁珠相结合，对照组鉴定到的蛋白是非特异性的背景蛋白。
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