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知无不“研”,dna pull down 常见疑点解析
文章来源:genecreate
作者:genecreate
发布时间:2020-11-17 10:11
dna pull down 常见疑点解析
q1: 适配子dna单链,可以用带有互补链的磁珠进行pull down吗?如果可以,效率怎么样?一般需要怎么优化条件?
a:理论上说,若dna单链能够与磁珠上的互补链杂交成功,是可以进行pull down实验的; 效率如何不好确定,这个取决于两条dna单链是否能杂交成功、蛋白-dna结合的强弱、蛋白的丰度等。
q2: dna pull down的 原理?
a:针对目标区域设计特异性dna探针并进行生物素标记,生物素探针可与偶联在磁珠上的链霉亲和素结合;细胞蛋白提取物与磁珠-dna探针孵育,从而钓取与dna探针有特异性结合的互作蛋白质。
q3: 你们对外服务的检测项目有哪些?
a:细胞、动物/植物组织、菌体都可以做dna pull down, 我们还可以做的检测实验具体如下:
(1) rna-蛋白/rna互作及定位:rna pull down、rip、fish等;
(2) dna-蛋白互作:dna pull down、chip、emsa、双荧光素酶、酵母单杂等;
(3) 蛋白-蛋白互作:gst/his pull down、coip、酵母双杂等;
(4) 细胞学检测:细胞增殖-mtt/cck-8, 细胞凋亡, 细胞周期,细胞迁移、侵袭:划痕愈合/transwell/transwell(matrigel)等;
(5) 外泌体服务:提取、鉴定(nanosight粒径检测/电镜/wb)、
测序(mirna/lncrna)、蛋白质组学;
(6) 转录组及蛋白质组:真核有参转录组、无参转录组、真核lncrna、small rna等。
q4:效率有多高?
a:效率主要取决于蛋白-dna结合的强弱、蛋白的丰度等。
q5:老师,对照组的dna序列是怎么选择的?
a:一般对照组是没有探针的,对照组是磁珠beads 蛋白。
q6:dna pull down有什么缺陷吗?
a:dna pull down-ms是体外研究蛋白-dna是否有直接互作的经典技术,是将探针结合在凝胶/磁珠上,钓取与dna探针有互作的蛋白;就技术而言,没有明显的缺陷;后续质谱能鉴定到多少蛋白取决于蛋白-dna结合的强弱、蛋白的丰度等。
q7: 做dna pulldown 用dna单链好还是双链好?
a:常规的是用dna双链作为探针。
q8: 可以简单讲一下生物素标记引物的原理吗?
a:主要利用生物素(biotin)和亲和素(avidin)这两种分子的独特性质; 亲和素的每个亚基都能结合一个生物素分子,两者的结合是通过生物素的脲基环部分完成的;因此可将其戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连,构成生物素标记的核酸探针。
q9: 如果做转录因子,转录因子和dna结合发起转录,不应是和打开的单链结合吗?
a:启动子是位于转录起始位点(结构基因)5'端上游的dna序列,就像"开关",决定基因的活动,本身并不控制基因活动,而是通过与特定蛋白质(转录因子)结合而控制基因的活动。转录因子就像一面"旗子",指挥着酶(enzymes)(rna聚合酶polymerases) 的活动,这种酶制造着基因的rna复制本。转录因子是与启动子dna双链结合的。
q10:做100bp突变对照组应该怎么突变碱基?
a:可以通过查找相关资料确定启动子发挥功能的核心区域,将核心区域进行突变;一般是a/g互换,c/t互换突变。
q11: dna互补链可以相互钓取吗?
a:dna pull down 是研究蛋白-dna的互作,不可以用dna互补链相互钓取。
q12:请问dna为什么会与蛋白质互作呢,它们有什么功能的联系吗?
a:dna pulldown 是研究蛋白-dna的互作, 主要应用于寻找已知的启动子序列所结合的未知蛋白(转录因子);启动子是位于转录起始位点(结构基因)5'端上游的dna序列,就像"开关",决定基因的活动,本身并不控制基因活动,而是通过与特定蛋白质(转录因子)结合而控制基因的活动。
q13: 如果做小肽对细菌的作用是否也可以dna pull down?
a:小肽属于蛋白类, 做不了dna pull down。
q14:未加探针的对照组鉴定出蛋白是什么原因呢?
a:对照组是磁珠beads 蛋白,虽然没有探针,但少量蛋白可以与磁珠相结合,对照组鉴定到的蛋白是非特异性的背景蛋白。
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