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知无不“研”| pcr超全实验操作视频及实例protocol（视频 直播，实验从入门到精通)
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2020-07-24 09:13
近日，2019 年全国青少年科技创新大赛的一项获奖作品引发人们关注。这位获奖同学在实验记录中写到：2018.1.13 了解pcr技术的原理，知道pcr引物的设计......
（图片来源于https://www.sohu.com/a/407591540_600553?_trans_=000014_bdss_dklzxbpcgp3p:cp=）
那究竟什么是pcr？pcr的实验原理是什么？pcr实验怎么做？莫慌！请听小编一 一为大家解答~
pcr简介
pcr (polymerase chain reaction)，中文翻译为聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊dna复制。由1983年美国mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易dna扩增法，意味着pcr技术的真正诞生。到如今，pcr技术已广泛应用于生命科学、医学研究、遗传工程、法医学、考古学、人类学等领域。
实验流程举例说明
01 扩增样本数据分析
02 pcr扩增需准备的试剂
03 pcr扩增需准备的仪器
pcr仪
04 pcr扩增需要的程序
扩增样品主要有两个参数需要注意，一个是退火温度，一个是延伸时间，退火温度是根据gc含量决定的，通过软件分析，它的gc含量属于正常水平，所以我们设置56°。延伸时间是由扩增基因片段长度决定的，我们所使用的扩增酶pfu酶理论上每分钟可以扩增2000bp，扩增的样品大小大概660bp左右，所以设置30s应该是足够了。
05 pcr反应后，点胶检测其大小，待回收大小正确的目的片段
06 结果展示与分析
07 常见问题与解答
1、q: 不出现扩增条带？
a: 在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病。例如，模板中含有杂蛋白质，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦不宜随意更改。
2、q: 出现的pcr扩增条带与目的靶序列条带一致，但其条带更整齐，亮度更高（假阳性）？
a: 出现假阳性的原因有：①引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，在进行pcr扩增时，扩增出的pcr产物为非目的性的序列。因此，需重新设计引物。②靶序列或扩增产物的交叉污染。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及枪头等均应一次性使用。
3、q: 出现非特异性扩增条带？
a: 非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是mg2 离子浓度过高、退火温度过低及pcr循环次数过多有关。三是酶的质和量，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
4、q: 出现片状拖带或涂抹带？
a: 其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dntp浓度过高，mg2 浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dntp的浓度，适当降低mg2 浓度。③增加模板量，减少循环次数。
完结撒花
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