技术专题
为什么说新冠病毒疫苗研发困难重重？
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2020-04-23 09:41
疫情追踪
据海外网报道，美国约翰斯·霍普金斯大学发布的实时统计数据显示，截至北京时间4月22日6时30分左右，全球累计确诊新冠肺炎病例2553853例，累计死亡176323例。
（图片来源：360新冠肺炎实时疫情追踪）
新冠病毒来势汹汹，疫苗研发工作迫在眉睫，然而新冠病毒的“高度糖基化现象”，成为当前疫苗攻关的瓶颈之一。
看到这，人们不禁想问，糖基化是何方神圣？它如何帮助病毒躲避抗体追杀？
糖基化是一种广泛存在、结构复杂多变的蛋白质翻译后修饰，在细胞和机体内发挥着重要功能。在生物体中50％以上的蛋白质存在糖基化现象，包括核孔蛋白、染色质蛋白、rna聚合酶ii、蛋白翻译调控因子、转录因子等，其变化参与细胞识别、蛋白质折叠、血型决定系统、癌细胞转移、薄膜保护作用、物质转运等多种重要的生物学过程，从而导致炎症、肿瘤等疾病的发生。
在《病毒与宿主细胞的糖基化修饰及相关功能》（向田, 章晓联，2017）一文中，作者对常见的包膜病毒的糖基化位点做了对比。研究中列出了几种常见病毒包膜糖基化情况，如下图所示，hcv（丙型肝炎病毒）有4-11个糖基化位点，iav（流感病毒）有5-11个糖基化位点，ebola virus（埃博拉病毒）有8-15个糖基化位点，而hiv（艾滋病毒）则多达20-30个糖基化位点。
这些糖基化位点，对病毒有重要作用，会让病毒容易产生多种突变。病毒糖基化后就相当于人类使用了“易容术”，把自己原本的样貌伪装起来了，这样一来，人体注射疫苗后产生的的抗体不一定能够准确识别出体内新冠病毒，也就起不到预防新冠肺炎的作用了。
hiv的糖基化位点是流感病毒的3-6倍，这也是后来疫苗研发迟迟无法成功的主要原因之一。而新冠病毒的糖基化位点至少是hiv病毒的2倍，这也意味着疫苗开发工作变得异常艰难。
对于这样一个全球公共卫生问题，研究者几乎在夜以继日寻找破局之道，近期在biorxiv、science、cell等各大平台/期刊上接连刊登了多篇关于新型冠状病毒s蛋白糖基化位点及糖链类型的研究论文，引发了基础科研领域和制药工业界的广泛关注，下面我们一起看看这些里程碑似的研究成果。
01
the origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (covid-19) outbreak – an update on the status
the origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (covid-19) outbreak – an update on the status
sars-cov-2是一种包膜阳性单链rna（ssrna）冠状病毒。病毒rna的三分之二（主要位于第一个开放阅读框（orf 1a / b））编码16个非结构蛋白（nsp）。病毒基因组的其余部分编码四种必需的结构蛋白，包括刺突（s）糖蛋白，小包膜（e）蛋白，基质（m）蛋白和核衣壳（n）蛋白，以及几种辅助蛋白。sars-cov-2的s糖蛋白与宿主细胞受体血管紧张素转换酶2（ace2）结合，这是进入病毒的关键步骤。
02
site-specific n-glycosylation characterization of recombinant sars-cov-2 spike proteins
sars-cov-2表面的糖蛋白尖峰（s）是病毒入侵和宿主免疫反应的决定因素。在本文中，我们在完整糖肽水平上表征了s蛋白的位点特异性n-糖基化。在s蛋白启动子中鉴定出所有22种潜在的n-糖苷，发现它们被保存在753个sars-cov-2基因组序列中。在人类细胞表达的蛋白质亚基中，不同糖型对糖位的占据表现出显着的异质性，其中包括多达157种n-聚糖（主要是复杂类型）。相反，昆虫细胞表达的s蛋白含有38种n-聚糖，主要是高甘露糖型。我们的研究结果表明，聚糖的类型是由人和昆虫细胞中n-聚糖的差异加工决定的。
重组蛋白位点特异性n-糖基化表征的工作流程
（重组表达；不富集直接质谱， zic-hilic富集糖肽质谱，切糖链质谱；hcd模式下碎裂）
胰蛋白酶与glu-c互补鉴定，完整的n-糖肽与去糖基化肽结合起来的n-糖基化分析。糖基化序列均在s蛋白中保守。这表明糖基化对于病毒的重要性。
sars-cov-2 s蛋白的n-糖苷表征
03
cryo-em structure of the 2019-ncov spike in the prefusion conformation
美国国立卫生研究院（nih）疫苗研究中心与得克萨斯大学奥斯汀分校分子生物科学学院合作报道了新冠病毒（2019-ncov）s蛋白的首个冷冻电镜结构。新冠病毒s蛋白与宿主细胞ace2之间的亲和力是sars的10-20倍，相关研究结果或为后期疫苗和新型抗病毒药物的提供新的思路和研究基础。该研究论文已于2020 年3月13日在science杂志上 pubmed。（投稿到接受仅用9天！）
04
structure, function and antigenicity of the sars-cov-2 spike glycoprotein
2020年4月16日，美国华盛顿大学david veesler课题组在cell 杂志上，本文详细阐释了s蛋白在新冠病毒与宿主侵染和膜融合的机制。sars-cov-2的出现导致了90,000例感染和3,000例死亡。冠状病毒刺突（s）糖蛋白促进进入细胞，是抗体的主要靶标。确定了sars-cov-2 sectodomain三聚体的低温em结构，为疫苗和病毒进入抑制剂的设计提供了蓝图。
sars-cov-2 s糖蛋白的低温-em结构
sars-cov s诱导抗体中和sars-cov-2 s介导进入宿主细胞
05
emerging wuhan (covid-19) coronavirus: glycan shield and structure prediction of spike glycoprotein and its interaction with human cd26
2020年3月17日发表在“emerging microbes & infections”杂志上，学者发现新冠病毒与sars病毒均存在大量的糖基化位点（图中绿色为预测的covid-19，蓝色为sars-cov，黄色为3c-like蛋白酶切割位点）。
06
site-specific analysis of the sars-cov-2 glycan shield
2020年3月28日，来自南安普敦大学等机构的科学家们通过研究揭示了引发covid-19的冠状病毒sars-cov-2的基本特征。疫苗的开发集中在体液免疫反应的主要靶标，即突触（s）糖蛋白，它介导细胞进入和膜融合。sars-cov-2 s基因每个原癌基因编码22个n-连接的糖基序列，可能在免疫逃避和阻塞免疫原性蛋白表位中起作用。作者使用位点特异性质谱方法揭示了重组sars-cov-2 s免疫原上的聚糖结构。作者还展示了sars-cov-2 s聚糖与典型宿主聚糖加工的不同之处，后者可能对病毒病理生物学和疫苗设计产生影响。
sars-cov-2 s糖蛋白的位点特异性n-联糖基化
sars-cov-2 s n-连接的聚糖的基于结构的作图
专家团队对于的疫苗研发工作正在争分夺秒进行中，相信未来可期。
4月19日，中国医学科学院医学实验动物研究所在biorxiv上传了题为“rapid development of an inactivated vaccine for sars-cov-2”的文章，这是我们知道的首个covid-19疫苗的公开数据。
作者开发了纯化的灭活sars-cov-2病毒候选疫苗（picovacc）的中试规模，该疫苗可在小鼠，大鼠和非人类灵长类动物中诱导sars-cov-2特异性中和抗体。这些抗体有效地中和了10个代表性sars-cov-2菌株，表明可能对全球流行的sars-cov-2菌株具有更广泛的中和能力。这些数据支持针对人类的sars-cov-2疫苗的快速临床开发。
pi co疫苗对非人类灵长类动物的免疫原性和保护作用
非人类灵长类动物pico疫苗的安全性评价
金开瑞提供糖基化蛋白质组鉴定，可实现对完整n-糖肽的定性和定量分析。
技术特点
- 采用亲水作用色谱在肽段层面富集完整n-糖肽，提高了富集效率；
- 采用二甲基标记定量技术，提高定量的准确性；
- 利用自主开发的gpseeker软件，可实现对完整n-糖肽的定性和定量分析。
适用范围
- n-糖基化修饰的糖链结构解析（适用甘露糖型、复合型、杂合型n-糖链）；
- 寻找疾病相关蛋白糖基化修饰规律；
- 分析糖蛋白糖链和糖结合蛋白相互作用的关联性；
- 探讨糖类相关基因和糖结合蛋白基因调控机制；
- 助力抗体药物质量评价。
服务流程
