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【战疫情】享春日之暖，品互作之美
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2020-03-26 14:32
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rna pull-down是检测rna结合蛋白与其靶rna之间相互作用的主要实验手段之一。使用体外转录法标记生物素rna探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成rna-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的rna结合蛋白是否与rna相互作用。
实验步骤
part01、构建rna过表达质粒：基因合成 测序验证
part02、体外转录模板准备：设计含t7启动子引物；pcr扩增得到转录模板
part 03、体外转录：以pcr产物为模板，体外转录得到目的rna
part04、rna pull down：通过磁珠-rna探针复合物富集互作的蛋白
part05、银染质检：sds-page电泳银染检测富集蛋白的情况
part06、质谱鉴定：通过质谱鉴定实验组与对照组的差异蛋白；进而筛选可能的互作蛋白
样品选择
- 获取难易程度：细胞系扩大培养即可，推荐；其他样品获取难度根据实际情况去考虑即可；
- 样品量：样品量直接影响提取蛋白的含量，最终影响富集蛋白量；
- 其他物质的干扰等影响因素：在没有细胞系的情况下，选择组织样品。动物组织中脂肪等物质存在影响；植物叶片组织叶绿素等物质丰度较高存在影响。
讲座q&a
q:能不能讲讲rip？
a:公司会根据需求合理安排，欢迎继续关注金开瑞后续的讲座。
q:一定要体外转录合成rna探针吗不能基因合成吗？
a:一般我们认为的基因合成是合成dna双链，体外转录只是获得rna的一种方式，相比化学合成纯度更高。所以pull-down实验一般是体外转录得到目的rna。
q:我想做神经系统某疾病的lncrnapulldown，选用细胞是用hek293t，还是神经元ht-22，还是将ht-22疾病模型后的细胞系？
a:选择ht-22细胞（细胞培养需要客户协助）
q:实验全程如何预防rna降解？做生物素标记的rna探针的目的？由rnapulldown延伸出来的mirna或circrnapulldown找结合的lncrna或mirna，跟lncrna蛋白的操作流程有何区别？
a:实验使用的所有试剂耗材需经过去rna酶处理；rna标记生物素后才能与链霉亲和素磁珠特异性结合；延伸的实验pull-down部分实验步骤是一样的（不需要体外转录）。
q:做lncrna pulldown 质谱一般会发现多个互作蛋白对吗？对这多个蛋白，如何选择就哪一种继续研究下去？
a:不同的rna结合蛋白数量不等，根据实际鉴定的蛋白进行筛选；筛选的原则是根据自己研究的方向或相关功能确定这类蛋白。
q:老师，请问一下lncrna构建全长序列超表达质粒或者转录序列时，是否需要加polya序列？以pc3.1或者3.0载体为例的话，加了polya和不加polya影响大吗？
a:一般是不需要加入polya序列，polya结构的功能与蛋白结合功能无关，反而会增加基因合成的难度。
q:那进行功能验证的时候也是不需要加polya？只是扩增完整序列就可以了吗？老师，按照你们的经验来看，每个反应需要的细胞量是多少合适？
a:功能验证构建过表达质粒可以加入polya；pull-down实验一般要求细胞量至少2*10的7次方。
q:质谱鉴定的蛋白主要是依据打分来进行筛选？这个筛选多少分算有效？
a:pull-down富集蛋白质谱分析后会剔除不可信蛋白，交付的都是可信蛋白，没有明确的打分。需要排序的话一般是根据鉴定蛋白特征性肽段的数目作为参考。
q:我想问下细胞裂解物里的酶是否还具有活性？比如rna甲基化，体外转录生成的探针，是否能在与裂解物共孵育的时候被甲基化？
a:酶发挥作用的机制一般也是很多分子协同作用，裂解后在短时间孵育过程催化反应很难实现。
q:想问下有推荐的银染试剂盒嘛？
a:赛默飞或者碧云天都可以，我们采用自己的银染方法。
q:想问下lncrna引物设计有什么注意事项么？或者说与普通的引物设计有什么区别么？
a:体外转录扩增的引物只需要在正向引物5端加入t7启动子序列即可。
q:请问细胞裂解物裂解的时候要不要加蛋白酶抑制剂还有rna酶抑制剂这些处理呀？细胞裂解物提取蛋白是要怎么处理？还是就是裂解细胞就行了？
a:细胞裂解需要加入蛋白酶和rna酶抑制剂，通常是反复冻融2-3次即可不需要超声处理。
q:我想请问下体内探针的设计和体外相比有什么优势吗？
a:通俗所说的体内探针是结合内源表达rna-蛋白复合物，更趋近反映天然结合蛋白的情况。
q:老师 rna pulldown如果不是用试剂盒，最后磁珠的洗脱条件，即不同盐离子梯度有什么推荐的吗?
a:盐离子梯度洗脱是否可以将蛋白洗脱下来我们没有尝试过，这个给不了推荐，不好意思。如果不用试剂盒洗脱buffer处理，我们可以加入loading buffer后高温处理，也是可以洗脱蛋白用于后续实验。
q:还有就是rna在转录出来后，其od一般都不高，可以使用吗？咋定量呢？
a:一般会进行电泳检测（dna电泳方式一样），可以根据maker浓度来判断rna的浓度。pull-down实验不需要精确的定量，都会加入过量的探针。
q:蛋白细胞裂解液的制备时可以超声裂解吗？
a:细胞裂解不需要超声处理，植物组织样品会短时间超声处理。
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山川异域
风月同天
今晚八点
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