技术专题
3月3号的讲座你参加了吗？
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2020-03-08 11:51
3月3号的的讲座你参加了吗？
停学不停课
金开瑞干货满满的线上讲座让你的课程/科研不再暂停
助力在线学习/办公，共战疫情
3月3日-3月13日期间
20:00-21:00
4场分子互作专题讲座
资深讲师接连开讲
抗疫期间，免费开放
第一讲已在3月3号顺利结束
再次感谢各位老师的支持和配合
现在
让我们一起来回顾一下上期的主讲内容
以及下期讲座精彩预告
课件获取方式
“金开瑞生物”微信公众号回复: 双荧光素酶
预告来袭
资深讲师
倾囊相授
还在等撒子嘛
报名从速哦
附：主讲老师对讲座期间各位老师疑问的解答
q1: 荧光素酶实验，操作细胞是？还是体外结合？
a1: 293t细胞，细胞内结合，狭义上的体外。
q2: 请问novel mirna 怎么预测靶基因?
a2: 如果starbase和targetscan网站没有收录这个novel mirna，只能在ncbi查找mirna序列和靶基因3’utr序列，在bibiserv2这个网站预测，但是这个网站的阳性率不如前面2个网站。
q3: 假如研究的是神经元细胞的mirna，工作细胞也还是用293t吗？
a3: 是的，金开瑞客户已发表的文章中研究沙棘鱼也是用的293t细胞，神经元细胞一般转染效率很低，而且报告基因质粒和mirna mimics都是外源转入的，只是借用了293t细胞里面的能量和元件，是可以反映神经元细胞里面的互作情况的。
q4: 老师，mirna和靶基因表达趋势一致，会有这种情况吗？
a4: 不排除存在这种情况，可以查阅文献，看是否有相关报道，了解其具体机制什么。
q5: 老师再讲一下那个载体荧光素和肠腔素以及靶基因的位置吧
a5: 可以结合ppt再听一遍录播视频，荧光素和腔肠素都是底物，裂解细胞后再加到反应体系里，发生氧化反应；载体上携带的是荧光素酶和海肾荧光素酶基因，后者无需插入任何元件，前者在上游插入启动子，或在下游插入靶基因3’utr，载体不一样。
q6: 做启动子和转录因子互做时，启动子突变怎么规则是什么样的？
a6: 可以看下文献中是怎么突变的，ppt里面也有展示，一般是嘌呤与嘌呤、嘧啶与嘧啶之间突变，比如a突变为g，t突变为c。
q7: mirna是质粒转的？可以直接合成的mirna转了做吗？
a7: mirna过表达是合成mirna mimics瞬转。
q8: 突变对照的设计上有标准吗？一般需要突变几个碱基？
a8: 没有严格的标准，一般将预测互作连续性最长的一段全部碱基都突变掉。
q9: 是不是也可以预测到启动子和转录因子结合的具体位置？
a9: 是的，ppt中有展示，用jaspar网站可以预测到互作的具体碱基。
q10: 转录因子和启动子结合检测那块没听到，网断了，能把找启动子和转录因子那块再说下吗？
a10: 可以结合ppt再听一遍录播视频，在ensembl网站查找启动子序列，在jaspar网站直接预测互作，转录因子的cds序列直接在ensembl或ncbi查找即可。
q11: 一般碱基如何突变? 有讲究么？
a11: 同a6。
q12: mrna和蛋白水平不一致，一般考虑什么问题?
a12: 是说相对于对照组，mrna有显著上调，而蛋白没有？这很正常，可能是mrna发生降解了。
q13: 做两个蛋白互作，用荧光霉素实验时，c-luc和n-luc载体和做转录因子的普通luc关系
a13: 研究2个蛋白互作，应该使用coip或者gst pull down的方法，而不是双荧光素酶实验。
q14: lncrna和mirna的结合验证，也是用荧光素酶实验对吗？和这次课里mirna靶基因结合，是否有区别？
a14: 是的，只是把mrna 替换为lncrna即可，starbase预测的时候选mirna-lncrna。
q15: 在哪个网站上预测的启动子与转录因子互作?
a15: jaspar，详细的预测方法见ppt。
q16: 根据以往经验,jasspr预测的启动子和转录因子的结合，验证后的准确率有多高呀？
a16: 有80%左右。
q17: 蛋白蛋白互作是用pull down吧?
a17: 同a13。
q18: lncrna转染细胞是靠慢病毒吧？质粒应该不行吧？
a18: 293t细胞很好转，无需包慢病毒，市面上可能也没有带荧光素酶的慢病毒载体。
q19: 老师 同一个mirna在一个疾病中 有的文献报道低表达 有的高表达 您有遇到过嘛？
a19: 很正常，如果是细胞样本，可能用的不同细胞株，比如宫颈癌细胞就有hela和siha；如果是病人组织样本，也存在个体差异性，或者治疗过和未治疗过。
q20: 老师，jaspar上预测分值多少为高分值?
a20: 遇到过最高的有9.9分，比较常见的是5-8分。
q21: 双荧光素酶实验是体外还是体内实验？
a21: 同a1。
q22: 荧光素酶的互作研究只需要选取一条序列来做吗？如果评分高的做不出来，是不就说明没有互作
a22: 看经费，如果经费充足，想节省时间，可以同时做3-5个位点，不排除存在高分阴性，而低分阳性的情况。
q23: 老师下次能否讲讲rip coip chip这类沉淀实验，很多问题看书查文献都没弄懂
a23: 可以，其他互作类的实验会由其他同事陆陆续续和大家分享。
q24: 老师 还有一个问题，我想提取干细胞的外泌体，想让外泌体中mirna高表达，可以用mirna mimic 干预干细胞嘛？还是只能用病毒转染呀？
a24: 可以直接用mirna mimics瞬转，用rna转染试剂，效率可能更高。
q25: 想问下，神经元细胞能转染lncrna进去吗？
a25: 同a3，神经元细胞转染效率一般较低，可以先转个带gfp的质粒拍照看看效果。
q26: 老师 有用双荧光报告基因筛选药物靶标的案例吗？
a26: 暂时没有接过这类，不过原理是一样的，也要构建报告基因质粒，只是把转录因子过表达质粒或mirnamimics替换成药物处理。
q27: 有关于lncrna的专题么？
a27: 关于lncrna可以做的实验很多，与互作相关的实验就有rip、rna pull down、fish等，后续会陆续和大家分享。
q28: 前面进来的晚了，请问老师为什么叫双荧光？
a28: 萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，2种荧光素酶，带这2种荧光素酶的质粒共转293t系统，后者作为内参，可以参考ppt原理介绍部分。
q29: 那为什么做出来的柱状图里不显示内参的结果呢？还是柱状图是比值结果
a29: 柱状图的纵坐标指的就是每组的萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值，即最终呈现的结果是已经做过均一化处理的。
q30: 最近正打算做个mirna和mrna的，targetscan预测分值81，这个验证出阳性的概率高吗?
a30: 81分属于比较高的了，可以再用starbase预测一下，如果2个网站最高分是同一个位点，可以尝试。
q31: 做mi rna 靶基因的，是不是一定要先wb跑出趋势才能去做荧光素呀？如果wb没趋势，是不是一定就不是了
a31: 双荧光素酶实验的灵敏性是wb的1000倍以上，就是前者可能有显著性差异了，而后者没有检测出差异。
q32: 想问一下老师，内参原则上不论怎么处理其值都不变才对，但是做了3次实验，内参结果都是处理组（病毒处理）的内参和对照组（不做处理）内参有些差异，数值在1-3之间的差异，老师，咱们遇到过这样的情况么？如有，这个可以接受么？
a32: 用病毒处理的目的是什么，过表达某个基因吗，那对照组应该用空载对照病毒感染，排除病毒对细胞的副作用。
q33: 荧光霉素有的不是这种柱状图比值的，是发光的那种颜色强弱来表示的，我想问一下，发光的那种只要只有luc就行嘛，还用不用ren？如果用，加还是两种染料嘛
a33: 有那种作图只放luc的，这种一般不太好，肯定别人也做了校准的，只是没呈现出来。 我们做启动子或mrna必须要海肾作为内参，不然就不叫双荧光素酶报告系统了，而叫单荧光素酶，有人也做单荧光的。
q34: 想问一下，老师有没有接过做启动子截短试验的项目，用双荧光素酶试验找出启动子活性最强的片段
a34: 可以先用预测网站promoter 2.0 prediction serve或bdgp:neural network promoter prediction预测出核心启动子区，再截取这段核心区域构建到报告基因载体中。
q35: 这个截短的分区有没有依据呢，一般怎么分
a35: 同a34。
q36: 病毒侵染细胞，选择宿主细胞的actin作为内参，实验组和对照组都设置三个重复，处理组组内的内参差异很小，对照组组内的内参差异也很小，但是实验组和对照组整体比较就有差异，老师咱们公司进行实验时实验组和对照组的内参值有差异么？
a36: 同a32，实验组和对照组一般差异比较小，要考虑是不是细胞状态很差的时候收的细胞。
q37: 老师 预测mirna与lncrna靶位点的好用的软件或者网站有推荐吗？
a37: 同a14，starbase可以。
q38: 老师，是否可以用18srna做内参？咱们用过18srna做过内参么？效果好么？
a38: 可以，但是我们没有尝试过，我们用gapdh、actin和u6比较多。
q39: mir引物设计可以直接使用文献里的设计序列码？
a39: 可以，但尽量选3分甚至5分以上的文章。
q40: 老师，想请问，做启动子区和转录因子的验证的话，如果做了双荧光素酶报告基因的话，还有必要做酵母单杂交吗？实际上，这两个实验的目的是完全一样的，对吧？
a40: 看经费，经费充足，时间充足，想发好一点的文章，可以做，用不同的方法验证同一个实验，更有说服力。
