技术专题
if=11.878，果蝇助攻，一文带你读懂hi-c～
文章来源：未知
作者：genecreate
发布时间：2020-06-01 16:39
关于hi-c
hi-c(high-through chromosome conformation capture)技术源于染色体构象捕获 （chromosome conformation capture, 3c）技术，以整个细胞核为研究对象，利用高通量测序技术，结合生物信息分析方法，研究全基因组范围内整个染色质dna在空间位置上的关系，通过对染色质内全部dna相互作用模式进行捕获，获得高分辨率的染色质三维结构信息。
（引自pueschel r, coraggio f, et al. from single genes to entire genomes: the search for a function of nuclear organization. development , 2016 , 143 (6) :910）
通过hi-c技术可以获得全基因组范围内的互作信息，得到染色体三个层级的三维结构：a/b compartment、拓扑相关结构域（tad）、染色质环（loop）。
● a/b compartment（常染色质/异染色质）具有组织、时期、状态特异性，在不同组织或不同时期或疾病状态间能够发生转换，这种转换和基因表达调控有一定关系。当染色体上某区域发生a/b compartment转化，会影响其中的基因的转录活性，通常b compartment转换为a compartment的区域相关基因大多表达上调，而a compartment转换为b compartment的区域相关基因则下调。
● tad（拓扑相关结构域）是一段具有折叠结构的dna序列，是基因组在空间结构中的基本组织形式。tad内部的互作频率会显著高于毗邻的两个区域之间的互作频率，tad结构在不同时空下（组织、发育阶段、状态等）具有一定的保守性，同时也存在一些动态变化。
● loops是dna在ctcf等蛋白质的介导下形成远距离互作，同样loop结构在不同时空下（组织、发育阶段、状态等）会有一些动态变化，且通过loop锚定的位点中包含启动子、增强子、沉默子等，当发生loop结构的动态变化，如新形成或消失，在一定程度上会影响基因的调控。
hi-c经典高分文献解读
题目：global chromatin conformation differences in the drosophila dosage compensated chromosome x.
期刊：nat commun
影响因子：11.878
主要技术：hi-c
研究背景
剂量补偿（dc）是在不同性别具有不同核型的物种中负责平衡性染色体转录输出的过程。在果蝇中，dc是通过雄性染色体x（chrx）活性基因表达上调两倍来实现的。整个过程由雄性特异性致死（msl）复合物（包括蛋白质和非编码rna），也称为剂量补偿复合物（dcc）统筹安排。其他模型生物的研究表明，dc和基因组的3d区室化之间存在相互作用。在胎盘哺乳类动物中，dc导致雌性x染色体的一个拷贝（chrx）沉默，是表观遗传调控研究最多的例子之一。黑腹果蝇中涉及的转录平均增加了两倍，与其他全染色体范围协调转录调控（例如哺乳动物dc）相比，可以预测dc在chrx结构中产生的变化较小。
作者使用hi-c检测黑腹果蝇中剂量补偿的chrx的3d染色质结构，首先证明剂量补偿的chrx参与了更多的中距离和远距离接触；其次，雄性和雌性结构域差异主要位于chrx上，并且结构域边界处绝缘减弱与dc机制有关。这些边界还与绝缘体（beaf-32、cp190或chromator）相关，它们参与了性染色体的远程交互。已知dcc辅助因子clamp是通过增强可及性参与组织染色质结构，在这些边界附近观察到不同的clamp结合信号。最后，观察到雄性活跃基因附近的边界之间远程互作比在雌性中更高。
研究结果
1、chrx互作的全局差异
作者在按性别分类的16–18 h发育阶段的胚胎使用hi-c技术，验证雄蝇中经剂量补偿的chrx是否具有不同的3d结构。首先研究雄性和雌性chrx在整体互作模式上的差异，发现在中/远距离（500 kb–1 mb）雄性与雌性hi-c信号比增加，其中许多互作矩阵中的点在雄性chrx中信号更高（图1a）。
作者观察到，在交互频率与距离的对数图中，同一数据集中chrx线是雄性和雌性样本之间唯一的区别。随着距离的增加，chrx线逐渐远离常染色体，但这在雌性样品中未观察到。表明相互作用的频率随距离的衰减较慢，这的确会导致中/远距离的相互作用频率相对较高。
图1 雄性chrx中距离/远距离的互动频率更高
2、互作模式显示雄性chrx可及性更高
由于单拷贝雄性chrx产生的读数比双拷贝雌性chrx相对较少，因此预期这会在互作的数量上产生偏差。为了克服此限制，作者设计了一种非参数方法来比较互作模式。由于dcc作用，剂量补偿的chrx显示出转录活性增加。结果表明，在雄性chrx中观察到的互作衰减的差异斜率（图 1b）可以通过缺乏配对的同源染色质和更具活性的染色质来解释。配对的雄性chrx是一种更加灵活和活跃的染色质，即使在长距离下也容易出现随机波动和相互作用。模拟数据中的差异幅度小于实验数据中的差异，并且仅在距离更长（≥5 mb）时才观察到，证明仅配对不足以解释观察到的模式，染色质可及性的局部变化可能有助于解释互作分布的差异。
图2雄性chrx中的顺式互作更分散，反式互作更多
3、结构域的局部差异
为研究剂量补偿的chrx是否也可能在结构域上显示差异，作者分析了tad。比较结构域边界时，相对于常染色体，chrx中观察到更大比例的不匹配结构域边界（图 3a），这些差异的一小部分被称为tad边界中的短程移动。作者开发了一种结构化的结构域边界调用过程，称为本地分数区分符（lsd）。作者将lsd应用于hi-c矩阵，并在chrx上确定了851个边界，chrx始终显示出高比例的结构域边界不匹配。
图3 不同性别的chrx特异tad边界不同
4、剂量补偿机制和绝缘子结合
作者研究dc的分子机制如何与雌性和雄性chrx之间的结构差异有关，将结构域边界之间的差异定性分类为相同（不变），出现（雌性不存在但在剂量补偿的雄性中发现的边界）或消失（在雌性中检测到但雄性不存在的边界）。在chrx中检测到的851个边界中，有377个（44.3％）边界被标注为相同，出现的边界为174个（20.4％），消失的边界为300个（35.3％）。作者观察到靠近消失的结构域边界的msl富集的结合位点，以及clamp（msl结合因子）的富集。作者进一步研究了msl和clamp结合位点与结构域边界之间的距离关系，与前人的研究相似，包含beaf和cp / ch峰的消失边界在附近具有更多msl和clamp结合位点。
作者又研究绝缘子结合的差异是否是雄性和雌性结构域边界的差异，通过全基因chip富集结构域边界包含或接近的绝缘子峰，相同和消失的结构域边界类别在雄性和雌性细胞上均显示出相似的模式 ，而出现的边界绝缘子峰的密度更低，结果未显示出绝缘子的结合与不同性别之间结构域边界的局部差异之间存在明显的相关性。作者根据beaf-32、cp190和chromator的富集信号水平对结构域边界进行了重新分类，观察结果表明，三个关键的绝缘子（beaf-32、cp190、chromator）与所有染色体的远程互作网络相关。chrx特异性绝缘子的差异与msl和clamp的结合有关，这表明dc与局部染色质区室化差异之间存在关联。
图4 结构域边界的变化与剂量补偿功能有关
5、结构域绝缘差异和染色质可及性
为了阐明结构域边界处较低绝缘与dc之间的关联，作者研究了敲除和未敲除特定dcc成分或辅因子的胚胎与雄性和雌性细胞系中染色质的可及性。结果表明，绝缘子结合染色质区参与长距离相互作用，显示雄性特异性chrx隔离较低。雄性chrx通常在这些位点可及性更高，在这些区域附近优先发现活跃的基因，并且此类基因在tsss附近雄性的可及性高于雌性。作者的研究表明与dc相关的染色质可及性的局部变化反映在hi-c接触数据中，特定区域边界周围的绝缘性较低。
图5 独立数据集显示选定边界的可及性更高
图6 msl关联了beaf 和cp / ch 边界附近的clamp
总结
为平衡不同性别之间的转录输出，雄性果蝇单个x染色体转录上调平均进行两次。之前的研究假设这一过程可能伴随染色体结构的整体变化，但是最近基于hi-c的研究未能发现这些差异。通过利用自定义数据分析使用按性别分类的胚胎以及分析雄性和雌性细胞系上的hi-c数据，作者研究表明染色质全局构象差异特别存在于雄性x染色体中，作者发现雄性x染色体具有更多的中/远距离相互作用。作者还确定了包含beaf-32协同cp190或chromator的结构域边界的差异，雄性x染色体中结构域边界减弱以及剂量补偿复合物结合辅助因子clamp，可增强染色质的可及性。总之，作者的数据强烈表明x染色体剂量补偿会影响整体染色体结构。
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武汉金开瑞生物工程有限公司提供的dlo hi-c技术，是一种创新的染色质构象捕获技术，此技术信噪比高，质量控制于早期，为解析基因组三维结构提供了一种新型、高效、经济的研究方案。
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