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客户文献解读| if=7.7, 组学揭秘氧化石墨烯暗藏的抗菌机制
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2020-06-01 17:00
热烈祝贺河北科技师范学院 陈教授及其团队研究成果荣登environmental science nano（if=7.7，中科院1区）
题目：metabonomics-assisted label-free quantitative proteomic and transcriptomic analysis reveals novel insights into the antifungal effect of graphene oxide for controlling fusarium graminearum
期刊：environmental science nano
影响因子：7.7
合作技术：label-free
研究背景
真菌病原体禾谷镰刀菌（fusarium graminearum，fg）是镰刀菌枯萎病（ fusarium head blight，fhb）的病原体，镰刀菌是一种影响小麦和其他谷物（例如玉米）生产的全球性严重植物病。fg不仅造成作物产量和品质的重大损失，而且还会产生霉菌毒素，几乎破坏了受感染田间生产的所有谷物。传统上，最有效的方法是使用杀真菌剂（如多菌灵）进行化学控制，但是，农业中长期过度使用化学药品已经引起了许多严重的问题，包括增加的真菌抗性，化学残留物以及对环境和健康的危害。真菌对某些传统杀真菌剂产生的抗性使控制真菌的生长更加困难，鉴于当前控制措施的局限性以及fhb 对重要经济作物的严重影响，开发有效控制这些疾病的替代剂已迫在眉睫。
氧化石墨烯（graphene oxide，go）作为一种新型的抗植物病原体的抗菌剂开始被研究，并且被认为在农业科学中具有巨大的发展前景。之前已有文章对go的抗菌作用进行了研究，然而对于go的抗真菌模式仍然未知。
为了探究go的抗菌机制，作者利用转录组，蛋白质组学和代谢组学技术，系统地研究了go对重要的植物病原真菌禾谷镰孢（fg）菌株ph-1的抗真菌活性，探讨其抗菌机制，以便更好的利用g0服务农业生产和改善环境。
实验思路
实验结果
1. go处理可以减少fg菌株ph-1的分支和生物量
用go处理fg菌株ph-1，通过对菌丝分支和生物量的统计，发现随着go浓度的增加，菌丝分支和菌丝体生物量都有明显的减少，说明go影响菌株的生长和发育。
图1 菌丝分支/生物量随go浓度变化
2. 菌丝体在go处理后丧失了细胞膜结构的完整性
作者利用sem和tem观察菌丝体对go处理的超微结构变化。根据sem图像观察到对照中的菌丝体保持了其膜结构的完整性，大多数菌丝体在go处理后丧失了其细胞完整性，并变得伸长或扁平化。同时tem图像显示，go处理后，菌丝体细胞壁的电子密度降低，细胞壁分层不明显。此外，go处理的菌丝体细胞中有更多的大隔室；还可以看出go处理后菌丝中存在许多液泡，并且可以观察到膜融合的现象，这可能是由于go处理引起的细胞膜通透性的变化。先前的研究表明，由于石墨烯与脂质分子之间的强相互作用，go可以从大肠杆菌膜中破坏性提取磷脂。由此，可以推测go可以帮助从菌丝体中破坏性提取磷脂并影响膜通透性，从而导致胞质外渗，继而在处理过的菌丝中形成较大的隔室。
图2 go处理后的sem 与tem 图像信息
3. 定量rt-pcr揭示go浓度对菌株的影响
作者进一步检测了与菌丝体发育和分支相关的几个基因的表达水平，并且进行应激相关基因的表达检测。通过改变go浓度，检测了septins，pods，map激酶和myo2等与菌丝体的发育和分支密切相关的基因，发现随着go浓度的升高，这些基因的表达量明显降低；与应激相关的基因uspa1，uspa2和sim表达量随浓度的升高有明显的升高；抑制细胞增殖的基因ras2，随着go浓度增加表达量也逐步增加。诸如此类，这些基因表达量的变化均表明go处理能降低菌株细胞活力，减少菌株菌丝体的分支和生物量。
图3 rt-pcr检测相关基因表达
4. 蛋白质组学要说的故事
a)通过label-free无标记定量蛋白质组学，作者发现不同go浓度处理，从根本上改变了菌株的基因本体条目，使菌株体蛋白表达水平发生了大的变化。其中，与细胞、代谢过程、细胞结构相关、催化活性、细胞过程等相关的蛋白质，以及应激蛋白和膜封闭蛋白的变化较为明显。
b)通过对差异蛋白的分析聚类，作者发现这些蛋白质主要参与能量、糖、氨基酸和n-聚糖的生物合成、脂肪酸代谢等途径。这些结果表明go处理影响离子通道以及核苷酸和脂质代谢蛋白，这与菌丝体脱水，dna和rna含量降低以及细胞壁合成密切相关。这一发现与表型结果一致。
c)此外，作者进一步分析这些差异蛋白，发现部分差异蛋白的变化对维持菌株的生命活性起着重要的作用。即为了在不同浓度的go处理下存活，fg菌株ph-1可能会降低蛋白质表达以及某些不必要的生理和生化反应，这一现象值得进一步研究。
d)差异蛋白 kegg富集分析结果表明，go处理导致fg菌株ph-1中与组氨酸代谢有关的蛋白质蓄积，这可能是go在fg菌株ph-1上的抗真菌反应之一，而对组织特异性模块中蛋白质的cog分析表明，参与脂质合成的蛋白质减少可能是go对fg菌株ph-1的另一种抗真菌反应。
图4 对照组与go处理菌株fg株ph-1的蛋白质组学比较分析
图5 不同浓度氧化石墨烯处理的fg株ph-1蛋白表达层次聚类分析
图6 cog分析
5. 代谢组学分析
最后作者从代谢组学分析结果中发现，go处理后海藻糖含量增加，而海藻糖被认为是真菌的主要碳源，并且是发芽初期真菌中的重要抗应激物质，表明海藻糖可当作禾谷镰刀菌响应go处理的一种生物标志物。go处理后组氨酸的含量增加，也表明fg遭受go诱导的应激。此外，作为真菌细胞壁的重要成分，脂质在go处理后含量显着下降。这可能会导致细胞壁成分减少，从而导致细胞壁不健康。 这与作者的sem和tem观察结果一致。
图7代谢组学分析
小结
在这项工作中，作者研究了go在基因、蛋白质组和代谢水平三个层面上抑制fg菌株ph-1的生长和分支的分子抗真菌机制。在基因水平上，基因的异常表达会抑制菌丝体的分支和成熟，从而降低菌丝体的生物量；在代谢水平上， go处理能引起代谢途径和组氨酸代谢的富集，推测组氨酸代谢可能是go在蛋白质水平上的抗真菌反应之一，是应激反应的生物标志物；在蛋白水平上，参与细胞壁合成的脂质蛋白的数量在蛋白质水平上降低，影响菌丝体细胞壁合成。通过本次工作，作者提出go对fg菌株ph-1的抗真菌活性可能是由于该菌株在转录、蛋白质和代谢水平上与go的协同反应，并且这种潜在的抗真菌机制也可能通过使用go来有效控制其他真菌。未来的研究可以在生物测定中加入其他重要的植物病原菌，扩大氧化石墨烯的抗真菌活性谱。此外，将现有的杀菌剂与氧化石墨烯相结合，研制出具有不同作用模式的新型氧化石墨烯杀菌剂，这可能是控制作物中植物病原体的另一种有效途径。
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