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2021年小金与您有个约定!
文章来源:genecreate 作者:genecreate 发布时间:2021-01-18 17:02
 酵母单杂交
一、酵母单杂交
酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别dna结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析dna结合结构域信息等。
酵母单杂交
 
二、核蛋白酵母双杂交
核蛋白酵母双杂交技术最初由fields等人在研究酵母转录因子gal4性质时建立,后续经过不断改进已发展成为一种成熟的蛋白-蛋白互作研究工具,具有简便、灵敏、可反映蛋白在活细胞内互作真实情况的特点,被广泛应用于互作蛋白的筛选、蛋白相互作用的鉴定/验证、蛋白互作机理的探究、蛋白连锁图谱绘制等工作。
酵母单杂交
 
三、核酵母单/双杂交点对点验证流程简介及图片分析
 
a为诱饵,b为猎物。
筛选涉及到的报告基因:
(1)his3。
(2)ade2。
(3)mel1。
诱饵质粒pgbkt7携带trp基因, , 猎物质粒pgadt7携带leu基因。
筛选涉及到的平板:ddo[sd/-leu/-trp],ddo/x[sd/-leu/-trp/x-α-gal],tdo /x [sd/-leu/-trp/his3/x-α-gal],qdo /x[sd/-leu/-trp/his3/ade2/x-α-gal]
 
1、诱饵自激活验证
核酵母单/双杂
 
分析:诱饵质粒重组质粒pgbkt7-a和猎物空载pgadt7共转化y2hgold酵母菌株。(1)涂布ddo平板能够生长,说明诱饵pgbkt7-a pgadt7已成功转入宿主菌中且对宿主菌无毒性;(2)涂布tdo平板,不能生长,说明诱饵pgbkt7-a pgadt7无自激活现象,不能激活宿主菌报告基因his的表达;(3)涂布qdo平板没长,说明诱饵pgbkt7-a pgadt7无自激活现象,没有激活报告基因ade2。
 
2、共转验证——阴阳性对照
 核酵母单/双杂
3、共转验证——实验组
 核酵母单/双杂
 
分析:诱饵重组质粒pgbkt7-a和猎物重组pgadt7-b共转化y2hgold酵母菌株。(1)涂布ddo平板能够生长,说明诱饵pgbkt7-a pgadt7-b已成功转入宿主菌中且对宿主菌无毒性;(2)涂布tdo平板能生长,说明诱饵pgbkt7-a pgadt7-b能够互作,激活了宿主菌报告基因his3的表达;(3)涂布qdo平板能长,说明诱饵pgbkt7-a pgadt7-b能够互作,同时激活了报告基因his3和ade2的表达。
 
4、双杂点种图
 核酵母单/双杂
核酵母单/双杂
 
1自激活: y2h[pgbkt7-a pgadt7]
2实验组: y2h[pgbkt7-a  pgadt7-b]
3阳性对照: y2h[pgbkt7-53 pgadt7-t]
4阴性对照: y2h[pgbkt7-lam pgadt7-t]
 
5、酵母单杂点对点验证示意图
 
p为诱饵启动子,b为猎物。
单杂筛选报告和抗性基因:
abar/ aur-c,aur1基因的一个显性突变版本,编码肌醇磷酸化神经酰胺syn- thase酶。aur1-c在y2hgold/ y1hgold酵母株中表达,是由于蛋白质与蛋白质的相互作用,使gal4转录激活和dna结合域接近。可以添加aba进行背景抑制。,
诱饵质粒pabai携带ura基因,猎物质粒pgadt7携带leu基因。
筛选所用到的平板:sd/- leu,sd/- leu/ aba
酵母单杂
 
 
自激活结果分析:pgadt7空载转化含诱饵启动子pabai-py1hgold酵母菌株。
(1)涂布sd/-leu平板能够生长,说明诱饵pabai-p已成功转入宿主菌中且对宿主菌无毒性;
(2)涂布sd/-leu/aba(100ng/ml), sd/-leu/aba(200ng/ml) 平板能生长,说明200ng/ml的aba不能抑制报告基因abar/ aur-c ;
(3)涂布sd/-leu/aba(500ng/ml) ,sd/-leu/aba(800ng/ml),sd/-leu/aba(1000ng/ml)平板没长,说明能够抑制报告基因aur1-c的最低aba浓度为500ng/ml,后续可用aba(500ng/ml)进行共转验证。如果aba最高抑制浓度1000ng/ml仍然能够生长,则只能考虑截短诱饵启动子。
 
6、共转验证——阴阳性对照
 酵母单杂
 
7、共转验证——实验组
 酵母单杂
 
分析:诱饵启动子重组质粒pabai-p转化y1hgold酵母菌株涂布sd/-ura平板,挑取单克隆菌制备成感受态,将猎物重组质粒pgadt7-b转化到y1hgold【 pabai-p 】中。(1)涂布sd/- leu平板能够生长,说明猎物重组质粒pgadt7-b已成功转入宿主菌中且对宿主菌无毒性;(2)涂布sd/- leu / aba (500ng/ml)平板能生长,说明诱饵pabai-p pgadt7-b能够互作,激活了宿主菌报告基因abar/ aur-c的表达。
 
8、单杂稀释点种图
 酵母单杂
 
四、酵母单/双杂点对点技术优势:
1. 转化效率高,较少假阴性;
2. 设置严格的对照实验,排除假阳性和假阴性;
3. 酵母双杂系统采用多个报告基因,且每个报告基因上游调控区各不相同,可大幅度减少假阳性;
4. 报告基因整合到染色体上,使基因表达水平稳定,消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性;
5. 严格设置点种验证实验菌体生长状态,进一步验证是否互作及互作强弱;
6. 严格保存原始实验数据便于溯源。
酵母单/双杂点对点


 

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