gst融合蛋白沉降技术流程-凯发k8网页登录
gst融合蛋白沉淀技术(gst fusion protein pulldown)是常用的蛋白质互作研究技术,用于检测和鉴定特定蛋白与靶蛋白之间的相互作用关系。以下是gstpulldown融合蛋白沉淀技术的一般步骤流程:
构建gst-tagged融合蛋白:首先,在靶蛋白编码序列的n端或c端引入gst标签的编码序列。可以通过克隆、pcr扩增等方法将gst序列和目标蛋白的编码序列连接起来,生成gst-tagged融合蛋白。
表达和纯化gst-tagged融合蛋白:将gst-tagged融合蛋白的重组质粒导入细胞表达系统,如大肠杆菌。通过培养和诱导表达,使gst-tagged融合蛋白高效表达。接下来,使用亲和层析技术(例如,谷胱甘肽-sepharose柱)纯化gst-tagged融合蛋白,去除非特异性的蛋白和杂质。
靶凯发k8网页登录-凯发娱发k8官网:同时,制备目标蛋白(靶蛋白),可以通过细胞培养、组织提取等方法获得目标蛋白。
gst pulldown实验:将纯化的gst-tagged融合蛋白与目标蛋白混合,形成复合物。然后,在实验条件下进行反应,使复合物发生相互作用。可以在合适的缓冲液中进行反应,并添加必要的辅助因子(如磷酸酯酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等)来维持反应的适宜性。
gst沉淀:在gst pulldown反应完成后,使用谷胱甘肽-sepharose柱等亲和层析柱进行gst沉淀。gst-tagged融合蛋白通过与柱子上的谷胱甘肽结合的特异性,使复合物被沉淀下来。非特异性的蛋白和杂质则会被洗脱掉。
蛋白分离和分析:将沉淀下的复合物进行洗脱,得到gst-tagged融合蛋白和与之相互作用的靶蛋白。可以使用sds-page电泳和western blot等方法,对复合物进行蛋白分离和分析,从而确定目标蛋白与gst-tagged融合蛋白之间的相互作用。
通过gst融合蛋白沉淀技术,可以实现目标蛋白与gst-tagged融合蛋白的特异性结合,用于研究蛋白质互作、信号通路及功能调控等方面的问题。
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