bl21蛋白表达实验步骤-凯发k8网页登录
bl21是常用的大肠杆菌表达宿主菌株,用于蛋白表达实验。下面是一般的bl21蛋白表达实验步骤:
构建表达载体:将目标蛋白的编码序列插入适当的表达载体中,通常在载体上添加适当的标签(如his标签)以便后续纯化。
转化bl21菌株:将构建好的表达载体转化到bl21宿主菌株中。可以使用化学转化或电转化等方法。
选择阳性菌落:将转化后的细菌接种到含有适当抗生素的琼脂平板上,培养过夜。选择抗生素抵抗的阳性菌落作为进一步培养的起始菌株。
预培养:从阳性菌落中挑取单个菌落,接种到含有适当抗生素的液体培养基中,进行预培养。预培养能够扩增细菌数量,使其进入指数生长期。
大规模培养:将预培养的细菌接种到大规模培养基中,如luria-bertani (lb) 培养基,添加适当浓度的抗生素。培养条件包括温度、气氛和搅拌速度等要根据具体表达载体和蛋白的需求进行调控。
iptg诱导表达:在细菌进入指数生长期后,加入异丙基β-d-硫代半乳糖苷(iptg)来诱导目标蛋白的表达。iptg能够激活载体上的启动子,使得目标蛋白的转录和翻译得以进行。
细胞收获:培养一定时间后,细菌进入后期生长期,蛋白表达量达到峰值。此时,细菌可以被收获。
细胞破碎:将收获的细菌进行破碎,常用方法包括超声波处理、高压均化或冻融法等,以释放细胞内的蛋白。
纯化目标蛋白:使用适当的纯化方法,如亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析或凝胶电泳等,从细胞裂解液中纯化目标蛋白。
蛋白质定量和分析:使用适当的方法,如bca法或sds-page等,对纯化后的蛋白进行定量和分析,以确认目标蛋白的表达和纯度。
具体实验步骤可能因不同的蛋白表达系统、表达载体以及目标蛋白的特性而有所变化。因此,在进行实验前,建议参考相关文献和实验室内部的标准操作流程。
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