载体构建及原核表达实验步骤-凯发k8网页登录
载体构建和原核表达实验是常用的蛋白表达和功能研究方法之一。以下是一般的载体构建和原核表达实验的步骤:
获得目标基因:从适当的来源中获取目标基因的dna序列,例如通过pcr扩增、化学合成或从已知的质粒或基因组中提取。
选择适当的载体:选择合适的原核表达载体,如常用的pet系列、pgex系列等。确保载体含有所需的启动子、选择性抗生素标记和适当的多克隆位点等。
制备酶切位点:根据需要,将目标基因与载体进行酶切。在载体上选择适当的限制性内切酶位点,以便将目标基因插入到载体的多克隆位点中。
进行连接反应:将经酶切的载体和目标基因片段进行连接反应。在连接反应中使用dna连接酶(如t4 dna连接酶),使目标基因片段与载体正确连接。
转化感受态细胞:将连接后的重组质粒转化到适当的感受态细胞中。常用的感受态细胞包括大肠杆菌(如dh5α、bl21等)等。
筛选阳性克隆:将转化后的细胞涂布于含有相应抗生素的选择性培养基上,培养过夜进行筛选。筛选出带有目标基因的阳性克隆。
扩增重组质粒:从筛选得到的阳性克隆中提取重组质粒dna。使用合适的方法提取重组质粒,如mini prep或maxi prep等。
验证重组质粒:通过限制性内切酶切分析或测序确认重组质粒是否正确构建。
原核表达:将验证后的重组质粒转化至适当的原核表达宿主中,如大肠杆菌bl21(de3)。在适当条件下诱导目标基因的表达,如添加适量的异丙基β-d-硫代半乳糖苷(iptg)。
收集细胞:在适当的诱导时间后,收集含有目标蛋白表达的细胞。常用的方法是离心细胞沉淀并冻存,或者直接用裂解缓冲液裂解细胞。
分离目标蛋白:使用适当的分离方法,如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等,分离目标蛋白。
验证表达:通过sds-page、免疫印迹、质谱等方法验证目标蛋白的表达和纯度。
以上是一般载体构建和原核表达实验的基本步骤。具体实验步骤可能因实验目的、载体类型以及表达宿主的不同而有所差异。在进行实验时,请根据具体情况进行优化和调整实验步骤。
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