酵母双杂交筛库步骤-凯发k8网页登录
信息来源:金开瑞 作者:genecreate 发布时间:2023-08-22 16:38:02
酵母双杂交(yeast two-hybrid,y2h)是一种常用的蛋白质相互作用筛选技术。下面是酵母双杂交筛库的一般步骤:
构建靶蛋白的诱饵融合蛋白(bait):将感兴趣的靶蛋白的编码序列插入一个特定的表达载体中,与一个激活域(activation domain,ad)融合。这样构建的融合蛋白称为诱饵。
构建预制库:选择合适的组织来源或细胞系,提取总rna并进行逆转录pcr合成cdna。将这些cdna片段插入一个另一种表达载体中,并与一个dna结合域(dna binding domain,bd)融合。这样构建的融合蛋白称为靶蛋白。
融合蛋白的合成和表达:将诱饵和预制库构建载体转化到酵母母细胞(如saccharomyces cerevisiae)中。培养转化后的酵母细胞,在选择性培养基中进行培养,以筛选出真正含有诱饵和靶蛋白的酵母细胞株。
检测蛋白相互作用:将筛选得到的酵母细胞株进行进一步的检测,以确定蛋白相互作用的情况。常见的方法包括:β-galactosidase活性检测、荧光素酶报告基因检测等。
验证蛋白相互作用:通过进一步验证蛋白相互作用的酵母双杂交阳性结果,例如进行亚细胞定位研究、蛋白共沉淀等实验,来确认蛋白相互作用的可靠性。
酵母双杂交筛库是一种高通量的蛋白质相互作用筛选技术,能够在酵母细胞中模拟蛋白质相互作用,帮助研究者鉴定和研究靶蛋白与其他蛋白之间的相互作用关系。
上一条:噬菌体展示技术制备抗原的方法
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