酵母双杂交实验流程-凯发k8网页登录

信息来源:金开瑞 作者:genecreate 发布时间:2023-08-10 14:55:00

    酵母双杂交实验是一种常用的蛋白质相互作用研究方法。下面是一般的酵母双杂交实验流程:

    酵母菌株的选择:选择适用于双杂交实验的酵母菌株,常用的有saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)和schizosaccharomyces pombe(分裂酵母)等。

    构建酵母表达载体:将目标蛋白的编码序列克隆到适当的酵母表达载体中。通常使用双杂交酵母表达载体,其中包含激活域(activation domain, ad)和dna结合域(dna-binding domain, bd),两个域分别与融合的蛋白片段进行交换。

    构建表达融合蛋白的酵母菌株:将构建好的酵母表达载体转化到酵母细胞中,通过遗传选择或荧光筛选等方法,从转化的菌落中筛选出含有目标蛋白表达融合蛋白的单克隆菌株。

    构建酵母库:准备包含大量蛋白编码序列的酵母库,可以使用cdna文库、基因组文库等。

    进行双杂交筛选:将表达融合蛋白的酵母菌株与酵母库菌株交叉杂交。在选择性培养基上培养杂交的酵母菌株,只有具有相互作用的融合蛋白对才能生长并形成可观察的表型。

    鉴定阳性相互作用克隆:从筛选培养基上生长的菌落中挑选阳性克隆。可以通过β-galactosidase活性检测、荧光标记或其他方法来验证相互作用的存在。

    dna测序和数据分析:对鉴定出的阳性克隆进行dna测序,确认其含有的蛋白质编码序列。然后使用生物信息学工具进行数据分析,如功能注释、互作网络构建等,以进一步了解这些蛋白质之间的相互作用关系。

    通过以上步骤,可以使用酵母双杂交实验方法发现和验证蛋白质间的相互作用关系,为了解蛋白质功能和调控提供重要信息。在实验过程中需要严格控制实验条件,并进行适当的对照组实验,以确保筛选结果的可靠性和特异性。

 




x
网站地图