苄基异喹啉生物碱 (bia) 是植物中的一组多样化的含氮次级代谢物，仅存在于有限的植物科。具有药理意义，典型的药用 bia 包括吗啡和可待因（麻醉性镇痛剂）、血根碱和小檗碱（抗微生物剂）、筒箭毒碱和罂粟碱（肌肉松弛剂）以及诺卡品（止咳剂和抗癌剂）。然而，人们对bia的生物合成和调控知之甚少，本文章表明荷花两个iii组wrky转录因子(tfs)，nnwrky70a和nnwrky70b，正向调控荷花中bia的生物合成。且两种 nnwrky70 都对茉莉酸 (ja) 有反应，它们的表达谱与 bia 浓度和 bia 通路基因表达高度相关。为 wrky tf 在次级代谢物生物合成中的调节作用提供了有用的见解。

3.1 荷花wrky70s的核苷酸和蛋白质序列特征比较

     两个 nnwrky70s和其他先前表征的参与植物次生代谢调节的 wrky 进行系统发育分析。nnwrky70a和nnwrky70b 与参与调节拟南芥，长春花和短冬青的 mia 生物合成的atwrky70，crwrky1和opwrky1序列相似性很高（a）。且wrky 结构域中都包含一个核心七肽wrkygqk和一个保守的锌指基序 cx₇cx₂₃hxc（b）。表明nnwrky70a 和nnwrky70b 都是典型 iii 组 wrky 蛋白。

3.2 nnwrky70s 的表达谱和亚细胞定位

通过实时定量pcr对nnwrky70 s在不同荷花器官中的空间表达谱进行了判定，其中nnwrky70b主要在莲藕中表达，其次是根茎和叶，nnwrky70a在荷叶中表达（a）。而针对荷叶不同发育阶段 (s1-s7) ，两个nnwrky70基因表现出非常相似的表达模式，在整个测试的发育阶段都持续增加（b）。将nnwrky70s的编码区与gfp报告基因融合在本氏烟草中过表达来进行亚细胞定位分析, 表明 nnwrky70a和nnwrky70b 蛋白都有明显的核定位（c）。

3.3  nnwrky70 是反式激活 bia 通路基因启动子的 ja 响应 tf

已知 ja 通过激活 ja 响应性 tf 来触发大多数导致次级代谢物的生物合成途径，为了验证nnwrky70是否对 ja 有反应，通过检测它们在meja 处理后的样本中的表达，结果显示表达量在24h时增加了约5倍（a）；为了寻找nnwrky70a 和 nnwrky70b 启动 bia 生物合成的启动子区域，通过双荧光素酶实验对筛选的nntydc1、nncyp80g和nn7omt初步确定，nnwrky70a 只能激活pnntydc1启动子（b），而nnwrky70b 可以激活pnntydc1、pnncyp80g和pnn7omt2三个启动子（c）。为进一步确定 nnwrky70a 和 nnwrky70b与这些启动子结合位点，将正常启动子与缺失保守区域w-box的启动子进行酵母单杂验证，结果显示nnwrky70b 与 pnntydc1 和 pnncyp719a 结合，与pnncyp80g，pnn7omt弱结合（d），nnwrky70a 明显与pnncyp80g，pnncyp719a结合，与pnntydc1和pnn7omt弱结合，与nnncs1启动子均未结合。当从这些启动子中去除 w-box 时，它们都没有与 nnwrky70a 或 nnwrky70b 结合（d）。表明 nnwrky70a 或 nnwrky70b与 bia 生物合成基因启动子中的 w-box顺式元件特异性结合，从而激活ja 响应性 tf 来触发大多数导致次级代谢物的生物合成途径。

3.4  nnwrky70s的过表达增强了荷花中的 bia 积累

为了进一步确定 nnwrky70a 和 nnwrky70b 是否激活荷花中的 bia 生物合成，通过检测携带过表达载体的农杆菌浸润的花瓣，结果显示增强了荷花花瓣中的 bia 含量，同时发现nnwrky70a或nnwrky70b的过表达显著促进bia 途径基因nncyp80g、nncnmt、nn7omt和nncyp719a的转录，表明两个 nnwrky70 之间可能存在交互激活能力， nnwrky70a 和 nnwrky70b 都参与了植物中的 bia生物合成。

3.5  nnwrky70b 与 nnwrky70a、nnwrky53b 和 nnjaz1 蛋白发生物理相互作用

通过酵母双杂交cdna文库筛选试验进一步研究nnwrky70s和其他蛋白质在调节荷花 bia 生物合成中可能的相互作用。选择调节 bia 生物合成的更为显著的nnwrky70b进行研究，由于全长结构显示出强烈的自激活活性，因此将保留wrky 和锌指结构域的截短区域作为诱饵（a），将筛选得到的阳性结果做进一步的杂交验证，得到nnwrky70b 与 nnwrky70a、nnwrky70b 与 nnwrky53b 以及 nnwrky70b与nnjaz1的互作结果（b），双分子荧光互补 (bifc) 实验进一步确定它们之间的互作关系。

在该项研究中，作者通过：（1）系统发育分析表明，nnwrky70a 和 nnwrky70b 为典型的可参与植物次生代谢调节的iii 组 wrky蛋白；（2）双荧光素酶和酵母单杂交实验表明，nnwrky70a 和 nnwrky70b 可以特异性结合bia 途径基因启动子的 w-box顺式元件，从而正向调节荷花 bia 生物合成，nnwrky70b 的 bia 生物合成激活比 nnwrky70a 更强；（3）酵母双杂交和 bifc 分析进一步揭示nnwrky70b通过与在调节荷花 bia 生物合成中的关键蛋白之间的相互作用，调节荷花 bia 生物合成。以上的研究结果证明了 nnwrky70 tfs 在激活荷花中 bia 的生物合成中的积极调节作用，并为通过基于 tf 的基因工程提高 bia 产量提供了可行的策略。