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酵母杂交项目文章| 茉莉酸反应性转录因子nnwrky70a和nnwrky70b正调控荷花中苄基异喹啉生物碱的生物合成
文章来源:genecreate 作者:genecreate 发布时间:2022-09-01 15:48
本期解读
 

题目:jasmonate-responsive transcription factors nnwrky70a and nnwrky70b positively regulate benzylisoquinoline alkaloid biosynthesis in lotus (nelumbo nucifera)

期刊:frontiers in plant science

影响因子(if):6.627

发表时间:2022年6月15日

合作项目:酵母单杂交筛选及核酵母双杂交验证

 

01
研究背景:

   

苄基异喹啉生物碱 (bia) 是植物中的一组多样化的含氮次级代谢物,仅存在于有限的植物科。具有药理意义,典型的药用 bia 包括吗啡和可待因(麻醉性镇痛剂)、血根碱和小檗碱(抗微生物剂)、筒箭毒碱和罂粟碱(肌肉松弛剂)以及诺卡品(止咳剂和抗癌剂)。然而,人们对bia的生物合成和调控知之甚少,本文章表明荷花两个iii组wrky转录因子(tfs),nnwrky70a和nnwrky70b,正向调控荷花中bia的生物合成。且两种 nnwrky70 都对茉莉酸 (ja) 有反应,它们的表达谱与 bia 浓度和 bia 通路基因表达高度相关。为 wrky tf 在次级代谢物生物合成中的调节作用提供了有用的见解。

 

02
研究路线

 

核酵母双杂交验证

 

03
结果分析

 

 

3.1 荷花wrky70s的核苷酸和蛋白质序列特征比较

     两个 nnwrky70s和其他先前表征的参与植物次生代谢调节的 wrky 进行系统发育分析。nnwrky70a和nnwrky70b 与参与调节拟南芥,长春花和短冬青的 mia 生物合成的atwrky70,crwrky1和opwrky1序列相似性很高(a)。且wrky 结构域中都包含一个核心七肽wrkygqk和一个保守的锌指基序 cx7cx23hxc(b)。表明nnwrky70a 和nnwrky70b 都是典型 iii 组 wrky 蛋白。

 

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3.2 nnwrky70s 的表达谱和亚细胞定位

通过实时定量pcr对nnwrky70 s在不同荷花器官中的空间表达谱进行了判定,其中nnwrky70b主要在莲藕中表达,其次是根茎和叶,nnwrky70a在荷叶中表达(a)。而针对荷叶不同发育阶段 (s1-s7) ,两个nnwrky70基因表现出非常相似的表达模式,在整个测试的发育阶段都持续增加(b)。将nnwrky70s的编码区与gfp报告基因融合在本氏烟草中过表达来进行亚细胞定位分析, 表明 nnwrky70a和nnwrky70b 蛋白都有明显的核定位(c)。

 

核酵母双杂交验证

 

3.3  nnwrky70 是反式激活 bia 通路基因启动子的 ja 响应 tf

已知 ja 通过激活 ja 响应性 tf 来触发大多数导致次级代谢物的生物合成途径为了验证nnwrky70是否对 ja 有反应,通过检测它们在meja 处理后的样本中的表达,结果显示表达量在24h时增加了约5倍(a);为了寻找nnwrky70a 和 nnwrky70b 启动 bia 生物合成的启动子区域,通过双荧光素酶实验对筛选的nntydc1nncyp80gnn7omt初步确定,nnwrky70a 只能激活pnntydc1启动子(b),而nnwrky70b 可以激活pnntydc1pnncyp80g和pnn7omt2三个启动子(c)。为进一步确定 nnwrky70a 和 nnwrky70b与这些启动子结合位点,将正常启动子与缺失保守区域w-box的启动子进行酵母单杂验证,结果显示nnwrky70b 与 pnntydc1 和 pnncyp719a 结合,与pnncyp80gpnn7omt结合(d),nnwrky70a 明显与pnncyp80g,pnncyp719a结合,与pnntydc1和pnn7omt弱结合,与nnncs1启动子均未结合。当从这些启动子中去除 w-box 时,它们都没有与 nnwrky70a 或 nnwrky70b 结合(d)。表明 nnwrky70a 或 nnwrky70b与 bia 生物合成基因启动子中的 w-box顺式元件特异性结合,从而激活ja 响应性 tf 来触发大多数导致次级代谢物的生物合成途径。

 

苄基异喹啉生物碱
蛋白质序列

 

3.4  nnwrky70s的过表达增强了荷花中的 bia 积累

为了进一步确定 nnwrky70a 和 nnwrky70b 是否激活荷花中的 bia 生物合成,通过检测携带过表达载体的农杆菌浸润的花瓣,结果显示增强了荷花花瓣中的 bia 含量,同时发现nnwrky70annwrky70b的过表达显著促进bia 途径基因nncyp80gnncnmtnn7omtnncyp719a的转录,表明两个 nnwrky70 之间可能存在交互激活能力, nnwrky70a 和 nnwrky70b 都参与了植物中的 bia生物合成。

 

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3.5  nnwrky70b 与 nnwrky70a、nnwrky53b 和 nnjaz1 蛋白发生物理相互作用

通过酵母双杂交cdna文库筛选试验进一步研究nnwrky70s和其他蛋白质在调节荷花 bia 生物合成中可能的相互作用。选择调节 bia 生物合成的更为显著的nnwrky70b进行研究,由于全长结构显示出强烈的自激活活性,因此将保留wrky 和锌指结构域的截短区域作为诱饵(a),将筛选得到的阳性结果做进一步的杂交验证,得到nnwrky70b 与 nnwrky70a、nnwrky70b 与 nnwrky53b 以及 nnwrky70b与nnjaz1的互作结果(b),双分子荧光互补 (bifc) 实验进一步确定它们之间的互作关系。

 

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04
讨论

 

在该项研究中,作者通过:(1)系统发育分析表明,nnwrky70a 和 nnwrky70b 为典型的可参与植物次生代谢调节的iii 组 wrky蛋白;(2)双荧光素酶和酵母单杂交实验表明,nnwrky70a 和 nnwrky70b 可以特异性结合bia 途径基因启动子的 w-box顺式元件,从而正向调节荷花 bia 生物合成,nnwrky70b 的 bia 生物合成激活比 nnwrky70a 更强;(3)酵母双杂交和 bifc 分析进一步揭示nnwrky70b通过与在调节荷花 bia 生物合成中的关键蛋白之间的相互作用,调节荷花 bia 生物合成。以上的研究结果证明了 nnwrky70 tfs 在激活荷花中 bia 的生物合成中的积极调节作用,并为通过基于 tf 的基因工程提高 bia 产量提供了可行的策略。

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