蛋白表达实验|抗体纯化定制|elisa试剂检测盒 -凯发k8网页登录

由于核酸在260 nm附近有强吸收，而蛋白质在280 nm附近有强吸收，从生物体内提取核酸时，常用od260/od280比值来评价核酸纯度 (比值在1.8～2.0之间)，这一判断是基于序列中a、g、c、t所占比例大致相同时的结果。而合成的dna/rna则不同，序列很短 (通常在20～30个碱基之间)，其中a、g、c、t各种碱基所占比例很不相同，由于各种碱基的摩尔消光系数不同，因此不同碱基构成的合成dna/rna制品的od260/od280比值也不同，例如当序列中c、t碱基的含量高时，该比值会大大低于1.8。此外，序列中碱基的排列顺序也影响该比值。所以不能根据od260/od280比值来评价合成dna/rna制品的纯度。

oligo dna的电泳一定要使用变性page电泳。oligo dna是单链dna，容易形成复杂的立体结构，因此进行agarose电泳时，容易出现多条泳带 (更无法用agarose电泳进行定量了)。

a、g、c、t的组份不同，电泳速度不同； dna的立体结构不同，电泳速度不同。 这种情况在oligo dna越短时越容易发生，长链oligo dna之间差别越小。

没有，5' 和3' 末端均为-oh基。如需要加磷酸基团，订货时请特别注明，此时需收取磷酸化 (po4修饰) 的费用。

不能。 因为etbr是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的dna/rna分子为单链，只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构，才能被etbr染色。由于不同制品的序列不同，形成双螺旋的能力不同，因此染色能力不尽相同，也就不能根据etbr染色带的亮度来对合成的dna/rna进行定量。

两条引物退火成功率达不到百分之百，里面会存在单链引物，引物退火后跑胶有杂链很正常，不能以此来判断单链引物纯度。

连接反应的引物如果没有5’磷酸基团，连接效率相对较低，但不是完全不能成功。 如果磷酸化的产物还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果以及核对引物的设计方案，如果都没有问题就要考虑改善引物退火的条件以及连接反应体系。

合成dna的长度为6～130个碱基；合成rna的长度为8～35个碱基。当合成的dna序列较长时，由于合成及纯化方法的限制,很难保证制品中每个序列都正确无误。此外需要说明的是：如果待合成序列比较特殊 (例如多个“g”连续出现等)，合成收率相对较低，我们可能会根据具体情况加收费用；有时我们也可能无法合成订购的序列，此时本公司保留不接受定单的权利。

干燥制品很稳定，-20℃下保存2年没问题。 溶解后的dna也请保存于-20℃，最好是分份保存，避免反复冻融。 溶液中的oligo dna在常温下放置3～4天应该没问题，但最好不要放置一个星期以上。其寿命与容器、溶剂的灭菌程度有关。

干燥制品如能存放于-80℃是最理想的，如不能请于-20℃保存，保存2年没问题。 溶液状态的rna最好保存在-80℃，如无条件，请保存于-20℃。

如果您溶解引物的水ph过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用10mm tris ph7.5缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的ph值比较低（ph4-5）, 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是pcr使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。

合成的引物和您的定单序列一致，而不是能否扩增出您所需要的产物。

合成oligo dna时，尽量选用高纯度级制品。 避免使用过长的oligo dna，最好选用小于35 mer的合成dna制品。 进行克隆实验时，每次克隆都须进行测序验证，以保证序列的正确性，然后再进行进一步实验。进行蛋白表达实验时，尤其需要注意。

所有的制品纯化后都要进行脱盐，脱盐是使用c18柱进行的，偶而会有微量的树脂溢出而进入制品。树脂不影响任何反应结果，请稍许离心后取上清使用。

由于一般的pcr用引物的5′ 末端都没有磷酸基团，因此，扩增后的pcr产物的5′ 末端也没有磷酸基团。当克隆于去磷酸化的末端平滑载体时，无法克隆进去；而当克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时，背景会极高。此时请对pcr产物的5′ 端进行磷酸 (po4修饰) 化处理。

pcr反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。 1. 引物和模板是否配对，同源性有多大? 2. 引物本身是否有立体结构，或者二条引物之间是否形成高次结构? 3. pcr反应用试剂是否能正常工作? 4. pcr仪是否工作正常? 5. pcr反应条件是否合适? 如果一切正常，还无法解决问题时，我们可以免费重新合成引物。如果重新合成的引物也无法解决问题时，请把引物和模板寄送给我们公司，我们可以帮助摸索pcr反应条件。

基本不是。当今发展出各色各样的pcr扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决pcr扩增中遇到的扩不出，扩增效率低的问题。如槽式pcr就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。 有些重复片段的扩增, gc含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。 引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见： rt-pcr。请注意，很多基因通过常规rt–pcr方法是很难不增出来的。 rt- pcr成功的关键在于rt的反应的rna质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。 从基因组中扩增。一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组dna过高，会影响反应体系中的mg和ph。

由于核酸在260 nm附近有强吸收，因此常根据此性质，用紫外分光光度计测定核酸溶液在260 nm的吸光度值，据此对核酸进行定量，用od值来表示。1 od是指：置于光路长度为1 cm的比色皿中的dna/rna溶液，如果其在260 nm处的吸光度值为1，则称1 ml该溶液中溶解的dna/rna的量为1 od。1个od值的合成dna/rna的质量约为33 μg。将dna/rna溶液进行适当稀释，使吸光度测定值与样品浓度的关系在直线范围内，再根据原溶液的总体积与稀释倍数计算该溶液的总od值。 例如，一个200 μl的dna/rna溶液，如果对其进行6倍稀释，测定值为1.0时，则该溶液的总od值为：0.2 ml×6×1.0 od/ml=1.2 od 。

金开瑞目前使用的是absciex的5600 plus质谱仪和 q exactive™ hf 组合型四极杆-orbitrap ms。仪器性能：1灵敏度高：达到高端qqq的mrm的定量灵敏度；2高分辨：全质量范围内至少30000的分辨率；3高质量准确度：外标1 ppm；4超快的分析速度：扫描速度每秒一百张ms或ms/ms图谱，是其它高分辨质谱的5-10倍，达到三重四级杆mrm的扫描速度；5定量线性范围宽：超过4个数量级。