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q:什么是rip?
rip 技术(rna binding protein immunoprecipitation assay,rna 结合蛋白免疫沉淀)主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的rna-蛋白复合物沉淀下来,经过分离纯化就可以对结合在复合物上的rna 进行q-pcr验证或者测序分析。rip 是研究细胞内rna 与蛋白结合情况的技术,是了解转录后调控网络动态过程的有力工具,可以帮助我们发现mirna 的调节靶点。
根据需求,金开瑞可以提供rna/蛋白、rna/rna互作验证rip技术服务。
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q:在金开瑞做rip,需提供什么,可获得什么结果?
在金开瑞进行rip技术服务,您需要提供目的蛋白抗体(可用于ip)及其说明书;需检测的细胞样品;目的基因、目的蛋白信息。
实验完成后,金开瑞所交付的结果包含:原始数据、结果图片(包括阴性对照结果);标准实验报告(包括详细的材料与方法);sci标准result figure。
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q:rip试验主要应用哪些方面?
1) 已知蛋白与已知rna互作qpcr验证;已知蛋白与未知rna互作二代测序筛选。
2) 已知rna与已知rna互作qpcr验证;已知rna与未知rna互作二代测序筛选。
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q:rip试验需要注意些什么?
1) 防止rna与蛋白非特异性结合。
2) 避免rna蛋白质结合被破坏。
3) 避免外源rnase污染。
4) 抑制内源rnase的活性。
5) 避免rna结合蛋白的降解;
6) 选择适合做rip的抗体,一定要是ip级别的抗体。
7) 细胞的选择,对于需要做转染实验的需要选择转染效率较高的、rna在细胞中本底表达量要相对较高的
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q:为什么抗体无法沉淀rip裂解液中的目标蛋白?
1) 先进行ip或者wb,测试抗体可以与目标rbp结合。
2) 另选一个能与抗原其他表位结合的抗体。
3) 尽可能选用密理博ripab 抗体。
4) 稀释抗体成浓度梯度,进行ip测试。
5) 4℃过夜孵育抗体与rip裂解液。
6) 确定抗体类型与protein a/protein g匹配。
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q:rip可以分提核浆的rna-蛋白质复合物吗?
理论上,可以采用能分别抽提核浆蛋白的蛋白抽提kit先分离样本,再进行rip实验。但需要特别注意的是所用kit中的reagent不能有rnase和dnase,以及要能与下游的抗体beads孵育兼容。