2021年小金与您有个约定！ -凯发k8网页登录

 
一、酵母单杂交
酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具，被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控，如鉴别dna结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析dna结合结构域信息等。

 
二、核蛋白酵母双杂交
核蛋白酵母双杂交技术最初由fields等人在研究酵母转录因子gal4性质时建立，后续经过不断改进已发展成为一种成熟的蛋白-蛋白互作研究工具，具有简便、灵敏、可反映蛋白在活细胞内互作真实情况的特点，被广泛应用于互作蛋白的筛选、蛋白相互作用的鉴定/验证、蛋白互作机理的探究、蛋白连锁图谱绘制等工作。

 
a为诱饵，b为猎物。
筛选涉及到的报告基因：
（1）his3。
（2）ade2。
（3）mel1。
诱饵质粒pgbkt7携带trp基因, ， 猎物质粒pgadt7携带leu基因。
筛选涉及到的平板：ddo[sd/-leu/-trp]，ddo/x[sd/-leu/-trp/x-α-gal]，tdo /x [sd/-leu/-trp/his3/x-α-gal]，qdo /x[sd/-leu/-trp/his3/ade2/x-α-gal]
 
1、诱饵自激活验证

 
分析：诱饵质粒重组质粒pgbkt7-a和猎物空载pgadt7共转化y2hgold酵母菌株。（1）涂布ddo平板能够生长，说明诱饵pgbkt7-a pgadt7已成功转入宿主菌中且对宿主菌无毒性；（2）涂布tdo平板，不能生长，说明诱饵pgbkt7-a pgadt7无自激活现象，不能激活宿主菌报告基因his的表达；（3）涂布qdo平板没长，说明诱饵pgbkt7-a pgadt7无自激活现象，没有激活报告基因ade2。
 
2、共转验证——阴阳性对照
 
3、共转验证——实验组
 
 
分析：诱饵重组质粒pgbkt7-a和猎物重组pgadt7-b共转化y2hgold酵母菌株。（1）涂布ddo平板能够生长，说明诱饵pgbkt7-a pgadt7-b已成功转入宿主菌中且对宿主菌无毒性；（2）涂布tdo平板能生长，说明诱饵pgbkt7-a pgadt7-b能够互作，激活了宿主菌报告基因his3的表达；（3）涂布qdo平板能长，说明诱饵pgbkt7-a pgadt7-b能够互作，同时激活了报告基因his3和ade2的表达。
 
4、双杂点种图
 

 
1自激活: y2h[pgbkt7-a pgadt7]
2实验组: y2h[pgbkt7-a  pgadt7-b]
3阳性对照: y2h[pgbkt7-53 pgadt7-t]
4阴性对照: y2h[pgbkt7-lam pgadt7-t]
 
5、酵母单杂点对点验证示意图
 
p为诱饵启动子，b为猎物。
单杂筛选报告和抗性基因：
abar/ aur-c，aur1基因的一个显性突变版本，编码肌醇磷酸化神经酰胺syn- thase酶。aur1-c在y2hgold/ y1hgold酵母株中表达，是由于蛋白质与蛋白质的相互作用，使gal4转录激活和dna结合域接近。可以添加aba进行背景抑制。,
诱饵质粒pabai携带ura基因，猎物质粒pgadt7携带leu基因。
筛选所用到的平板：sd/- leu，sd/- leu/ aba

 
 
自激活结果分析：pgadt7空载转化含诱饵启动子pabai-py1hgold酵母菌株。
（1）涂布sd/-leu平板能够生长，说明诱饵pabai-p已成功转入宿主菌中且对宿主菌无毒性；
（2）涂布sd/-leu/aba(100ng/ml)， sd/-leu/aba(200ng/ml) 平板能生长，说明200ng/ml的aba不能抑制报告基因abar/ aur-c ；
（3）涂布sd/-leu/aba(500ng/ml) ，sd/-leu/aba(800ng/ml)，sd/-leu/aba(1000ng/ml)平板没长，说明能够抑制报告基因aur1-c的最低aba浓度为500ng/ml，后续可用aba(500ng/ml)进行共转验证。如果aba最高抑制浓度1000ng/ml仍然能够生长，则只能考虑截短诱饵启动子。
 
6、共转验证——阴阳性对照
 
 
7、共转验证——实验组
 
 
分析：诱饵启动子重组质粒pabai-p转化y1hgold酵母菌株涂布sd/-ura平板，挑取单克隆菌制备成感受态，将猎物重组质粒pgadt7-b转化到y1hgold【 pabai-p 】中。（1）涂布sd/- leu平板能够生长，说明猎物重组质粒pgadt7-b已成功转入宿主菌中且对宿主菌无毒性；（2）涂布sd/- leu / aba (500ng/ml)平板能生长，说明诱饵pabai-p pgadt7-b能够互作，激活了宿主菌报告基因abar/ aur-c的表达。
 
8、单杂稀释点种图
 
 
1. 转化效率高，较少假阴性；
2. 设置严格的对照实验，排除假阳性和假阴性；
3. 酵母双杂系统采用多个报告基因，且每个报告基因上游调控区各不相同，可大幅度减少假阳性；
4. 报告基因整合到染色体上，使基因表达水平稳定，消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性；
5. 严格设置点种验证实验菌体生长状态，进一步验证是否互作及互作强弱；
6. 严格保存原始实验数据便于溯源。