rip技术实验原理与实验步骤-凯发k8网页登录
rip技术全称为rna immunoprecipitation,是一种用于研究蛋白质和rna之间相互作用的方法。该技术可以用于分离和鉴定与特定rna结合的蛋白质,并得到这些蛋白质的序列信息。以下将从实验原理和实验步骤两个方面详细介绍rip技术。
实验原理:
rip技术是基于抗体特异性识别的原理,依赖于rna与蛋白质之间的物理交互作用。rip的基本思路是通过特异性抗体对靶蛋白进行免疫沉淀,然后提取rna并进行下游分析。具体而言,实验步骤包括以下几个关键步骤:
1、交联rna和靶蛋白:将细胞或组织处理后,加入足量的交联剂(如甲醛)进行交联处理,使rna与靶蛋白形成共价化合物,避免在抽提和免疫沉淀过程中的失活或丢失。
2、细胞裂解:添加胰蛋白酶等蛋白酶消化细胞膜,使其裂解,使rna和蛋白质能够充分接触。
3、加入特异性抗体:在裂解后的样品中添加特异性抗体,抗体与靶蛋白结合形成免疫复合物。
4、免疫沉淀:加入蛋白a/g磁珠或其他形式的亲和树脂,将免疫复合物沉淀下来。
5、去除非特异性结合蛋白:使用盐洗涤和一些高浓度盐或洗涤缓冲液(如ripa缓冲液),去除与免疫复合物非特异性结合的蛋白质。
6、去除交联:使用碱水解等方法去除rna和蛋白质之间的共价化合物。
7、rna提取:使用trizol或其他rna提取试剂盒进行rna提取。
8、下游分析:对rna进行逆转录和qpcr/ngs/微阵列等下游分析,以筛选出与目标蛋白质相互作用的rna。
二、实验步骤:
1、细胞或组织处理:将需要研究的细胞或组织处理,并加入足量的甲醛等交联剂进行交联处理。
2、细胞裂解:使用裂解缓冲液破坏细胞膜,释放内部物质,并得到rna和靶蛋白的复合体。
3、加入特异性抗体:在裂解后的样品中加入特异性抗体,使其与目标蛋白质结合形成免疫复合物。
4、免疫沉淀:使用蛋白a/g磁珠或其他亲和树脂,将免疫复合物沉淀下来。
洗涤免疫复合物:将样品在缓冲液中进行洗涤,去除与免疫复合物非特异性结合的蛋白质。
5、去除rna和靶蛋白之间的共价化合物:使用碱水解或其他方法去除rna和靶蛋白之间的共价化合物。
6、提取rna:使用trizol或其他rna提取试剂盒从免疫沉淀物中提取rna。
7、逆转录和pcr:对rna进行逆转录,并进行qpcr/ngs/微阵列分析,以获取与目标蛋白质相互作用的rna信息。
rip技术是一种用于研究rna与蛋白质之间相互作用的方法,可用于分离和鉴定与特定rna结合的蛋白质,并深入了解这些rna结合蛋白的功能。
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